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Adicionalmente, se utilizaron tres especies cultivadas como indicadoras, cuya germinación es uniforme y con sensibilidad conocida a gran variedad de aleloquímicos. Las especies cultivadas utilizadas fueron: ―avena‖ (Avena sativa), ―rye grass perenne‖ (Lolium perenne) y ―rabanito‖ (Raphanus sativus). Avena sativa es una planta anual, correspondiente a la clase Monocotyledoneae cultivada en la zona semiárida de Argentina. Por su parte, L. perenne taxonómicamente pertenece a la misma clase, con la diferencia que su hábito de crecimiento es perenne al igual que las especies nativas que también se evalúan en el presente estudio. Finalmente, R. sativus representa a la clase Dicotyledoneae, es una especie de importancia hortícola cuya utilización en bioensayos es habitual por su acentuada sensibilidad a los aleloquímicos.

5.2.1 Evaluación del potencial alelopático de B. ulicina sobre la germinación de especies nativas y cultivadas

Las semillas de las cinco especies utilizadas en el presente estudio fueron previamente esterilizadas superficialmente mediante el sumergimiento en hipoclorito de sodio 1% durante cinco minutos (Wakjira et al., 2011). Posteriormente, se lavaron con agua destilada durante tres minutos. Para cada especie y tratamiento fueron utilizadas cuatro réplicas de 25 semillas colocadas en cajas de Petri sobre papel de filtro Whatman no.1. Al inicio del ensayo se colocaron 6 mL de la solución correspondiente en cada una de las cajas de Petri y se sellaron con papel film luego de cada registro de germinación, a fin de mantener niveles de humedad homogéneos. Durante los siete días que duro el experimento las semillas fueron colocadas en cámaras de crecimiento bajo las condiciones óptimas para cada especie. Las especies cultivadas se mantuvieron a 25º C en oscuridad; mientras que, las especies nativas permanecieron a 24º C con un fotoperíodo de 12 hs. Se registró la

germinación los días 3, 4, 5 ,6 y 7, considerando semilla germinada a aquella cuya radícula alcanzaba una longitud mayor a 2 mm. La germinación acumulada al final del ensayo fue utilizada para calcular el porcentaje de germinación (PG); mientras que, con la totalidad de las mediciones se determinó la velocidad de germinación. Para ello se utilizó la fórmula de velocidad de germinación propuesta por González-Zertuche y Orozco-Segovia (1996), con una variante para obtener el resultado como un porcentaje:

donde GD3, GD4, GD5, GD6 y GD7 corresponden al número de semillas germinadas los días 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente. El 100% de velocidad de germinación se da cuando la totalidad de las semillas germinan antes de la primera evaluación (día 3).

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Los datos fueron procesados a través de un ANOVA doble, utilizando como variables clasificatorias el año y las distintas soluciones evaluadas. La comparación de medias se realizó por medio del test de Tukey (p<0,05), utilizando el programa estadístico INFOSTAT (Di Rienzo et al., 2008).

5.2.2 Evaluación del potencial alelopático de B. ulicina sobre el establecimiento de especies nativas y cultivadas

En el presente estudio se planteó el objetivo de evaluar el efecto de las soluciones realizadas a partir de distintos tejidos de B. ulicina sobre el establecimiento de las especies blanco, independientemente del proceso de germinación. Por este motivo, se procedió a obtener primeramente una germinación óptima de semillas para cada especie, y una vez garantizada, se procedió a la evaluación de los tratamientos sobre el establecimiento propiamente dicho.

Para ello, fueron colocadas numerosas semillas de las especies citadas en cajas de Petri bajo las condiciones óptimas de crecimiento para cada especie (iguales a las utilizadas para el estudio anterior) y se regaron con agua destilada. Luego de dos días de haber

germinado, se seleccionaron plántulas homogéneas y se dispusieron de a tres en recipientes con 180 cm3 de suelo (n=5) en condiciones de invernáculo (T: 21,7±4,3°C, HR: 43±19%). Cada recipiente fue regado durante 15 días con la solución correspondiente a cada tratamiento. Se utilizó un testigo, en el cual las plántulas fueron regadas con agua destilada. Luego de dos semanas se le asignó un valor de 0, 33, 66 o 99% de establecimiento a cada unidad de muestreo, de acuerdo si contaban con 0, 1, 2 o 3 plántulas establecidas. Se tomaron como plántulas establecidas aquellas que estaban vivas y en activo crecimiento.

Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado. Los resultados obtenidos fueron sometidos a ANOVA doble, empleando como variables clasificatorias el año y las distintas soluciones evaluadas. Las medias fueron separadas a través del test de Tukey (p<0,05) utilizando el programa estadístico INFOSTAT (Di Rienzo et al., 2008).

5.3 Resultados y discusión

5.3.1 Evaluación del potencial alelopático de B. ulicina sobre la germinación de especies nativas y cultivadas

Nassella clarazii

Las evaluaciones de germinación realizadas sobre N. clarazii no registraron interacción entre las variables años y soluciones estudiadas (F=0,93 p=0,4866), ni efecto del año (F=2,57 p=0,1163) o entre las soluciones evaluadas (F=1,82 p=0,1181). La germinación media total registrada fue de 87%, demostrando no ser sensible a las soluciones evaluadas (Fig. 5.1).

Figura 5.1. Porcentaje de germinación de semillas de Nassella clarazii en condiciones controladas (24°C y fotoperíodo de 12 hs), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012 (años unificados). Columnas acompañadas por la misma letra no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

En cuanto a la velocidad de germinación, se registró interacción entre las variables años y soluciones (F=20,73 p<0,0001), hallándose diferencias entre años (F=129,92 p<0,0001) y entre soluciones (F=27,42 p<0,0001). Se observó que como todas las soluciones disminuyeron la velocidad de germinación de N. clarazii (a excepción de Rz-B en

2011 y Pa-B en 2012), aunque en ninguno de los casos la disminución fue mayor al 30% con respecto al testigo (Fig. 5.2).

Figura 5.2. Velocidad de germinación de semillas de Nassella clarazii en condiciones controladas (24°C y fotoperíodo de 12 hs), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

Nassella tenuis

En la germinación de N. tenuis se registró interacción entre años y tratamientos (F=4,68 p=0,001), y diferencias altamente significativas entre años (F=26,42 p<0,0001) y entre soluciones (F=20,99 p<0,0001). La totalidad de las soluciones correspondientes al año 2011 afectó la germinación de N. tenuis, destacándose como menor valor de germinación el obtenido para el tratamiento Pa-A con sólo 18%. De las soluciones evaluadas en 2012, apenas tres se diferenciaron del testigo: Pa-B, Pc-A y Pc-B, con germinaciones de 40, 18 y 48%, respectivamente (Fig. 5.3).

En la velocidad de germinación no se encontró interacción entre variables (F=1,15 p=0,3526) pero si diferencias entre años (F=51,47 p<0,0001) y entre tratamientos (F=10,51 p<0,0001). Los tratamientos Pa-A y Pc-A disminuyeron la velocidad de germinación de N. tenuis en los dos años estudiados, con reducciones promedio de 21 y 24% (Fig. 5.4).

Figura 5.3. Porcentaje de germinación de semillas de Nassella tenuis en condiciones controladas (24°C y fotoperíodo de 12 hs), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

Figura 5.4. Velocidad de germinación de semillas de Nassella tenuis en condiciones controladas (24°C y fotoperíodo de 12 hs), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

Avena sativa

En la germinación de A. sativa se halló interacción entre los años y las soluciones evaluadas (F=2,55 p=0,0341). Tanto las diferencias registradas entre años (F=16,08 p=0,0002) como entre tratamientos (F=9 p<0,0001) fueron altamente significativas. En los

dos años estudiados, la solución con mayor efecto sobre la germinación de A. sativa fue Rz- A, con valores 60 y 58 % inferiores a los testigos de los años 2011 y 2012, respectivamente (Fig. 5.5).

Palacios et al. (2010) evaluaron soluciones de parte aérea (1%) de cuatro especies del género Baccharis sobre A. sativa, obteniendo resultados contrastantes. Mientras que, por un lado, registraron una germinación de A. sativa de 92% tras utilizar un extracto obtenido de plantas de B. flabellata, por otro lado, soluciones de B. artemisiodes, B. coridifolia y B. salicifolia sólo mostraron 9, 9 y 0% de germinación, respectivamente.

Figura 5.5. Porcentaje de germinación de semillas de Avena sativa en condiciones controladas (25°C y 0 hs de luz), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

En la evaluación del efecto de las distintas soluciones acuosas de B. ulicina sobre la velocidad de germinación de A. sativa se determinó interacción entre años y soluciones (F=8,05 p<0,0001), diferencias entre los tratamientos estudiados (F=24,19 p<0,0001), pero no entre años (F=0,4 p=0,5294). Se determinaron disminuciones en la velocidad de germinación para todas las soluciones con alta concentración de tejidos, a excepción de Rz- A en 2011 (Fig. 5.6).

Figura 5.6. Velocidad de germinación de semillas de Avena sativa en condiciones controladas (25°C y 0 hs de luz), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

Lolium perenne

En la germinación de L. perenne no se registró interacción entre años y tratamientos (F=0,75 p=0,6104), ni efecto debido al año (F=1,02 p=0,3191). Por esta razón los datos de germinación de ambos años fueron combinados, utilizando como única variable de clasificación los tratamientos de las diferentes soluciones (F=21,76 p<0,0001). Todas las soluciones con alta concentración afectaron la germinación de L. perenne, destacándose Rz-A, con una reducción del 67% respecto al testigo (Fig. 5.7).

No se determinó interacción entre años y soluciones para la velocidad de germinación de L. perenne (F=1,69 p=0,1476), aunque si existieron diferencias estadísticas entre años (F=45,19 p<0,0001) y entre tratamientos (F=46,71 p<0,0001). Todas las soluciones evaluadas disminuyeron la velocidad de germinación de L. perenne. A excepción de las soluciones de raíz correspondientes al año 2011, todas las soluciones provenientes de un mismo tejido de B. ulicina, tuvieron mayor efecto negativo cuando se encontraban en altas concentraciones (Fig. 5.8).

Figura 5.7. Porcentaje de germinación de semillas de Lolium perenne en condiciones controladas (25°C y 0 hs de luz), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012 (años unificados). Columnas acompañadas por la misma letra no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

Figura 5.8. Velocidad de germinación de semillas de Lolium perenne en condiciones controladas (25°C y 0 hs de luz), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

Raphanus sativus

La germinación de R. sativus registró interacción entre años y tratamientos (F=4,7 p=0,001), y diferencias entre años (F=4,97 p=0,0312) y tratamientos (F=10,87 p<0,0001). La

solución Pc-A fue la única en afectar la germinación de R. sativus los dos años, con disminuciones de 24 y 34 % respecto a los testigos de los años 2011 y 2012, respectivamente (Fig. 5.9).

Contrariamente, Maharjan et al. (2007) registraron inhibiciones totales de la germinación de R. sativus al embeber las semillas en soluciones de hoja de Parthenium hysterophorus (Asteraceae) con concentraciones de sólo 2%. Existen registros de extractos de hojas al 8% de concentración de Piper mikaniuanum, con los que se obtuvo 33 % de germinación de R. sativus (Borella et al., 2012).

Palacios et al. (2010) evaluaron soluciones de parte aérea (1%) de cuatro especies del género Baccharis sobre R. sativus, obteniendo resultados contrastantes. Por un lado, en tratamientos efectuados con extractos de B. artemisiodes, B. coridifolia y B. flabellata

hallaron germinaciones de R. sativus de 71, 98 y 88 %, respectivamente. Por otro lado, una solución realizada con tejidos de B. salicifolia inhibió completamente la germinación de R. sativus.

Figura 5.9. Porcentaje de germinación de semillas de Raphanus sativus en condiciones controladas (25°C y 0 hs de luz), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

En cuanto a la evaluación de la velocidad de germinación de R. sativus, se halló interacción entre las variables año y tratamiento (F=7,3 p<0,0001), así como diferencias entre años (F=16,8 p=0,0002), y entre tratamientos (F=74,06 p<0,0001). Las soluciones de Pa-A y Pc-A disminuyeron la germinación de R. sativus en los dos años estudiados, con disminuciones de la germinación de entre 27 y 41 % en relación a su testigo (Fig. 5.10).

Rashid et al. (2010) también registraron importantes disminuciones en la velocidad de germinación de R. sativus utilizando soluciones de hoja y raíz de Pueraria montana

(Asteraceae), inclusive aún, con una baja concentración (2,5%).

Figura 5.10. Velocidad de germinación de semillas de Raphanus sativus en condiciones controladas (25°C y 0 hs de luz), tras ser irrigadas durante una semana con agua destilada (testigo), o soluciones acuosas de raíz (Rz), parte aérea (Pa) y planta completa (PC) de B. ulicina en concentraciones de 15% (A) y 5% (B), realizadas con plantas cosechadas en 2011 y 2012. Columnas acompañadas por la misma letra, dentro de cada año, no difieren entre sí según Tukey (p<0,05).

5.3.2 Evaluación del potencial alelopático de B. ulicina sobre el establecimiento de