en la resistencia a antibióticos
El Zn(II) es esencial para la función de las MBLs, siendo necesaria su presencia en el sitio activo tanto para la unión de sustrato como la catálisis32. Es por ello que la capacidad de estas enzimas de adquirir y retener los iones metálicos condiciona su potencial como determinante de resistencia.
Luego de ser sintetizadas las MBLs son exportadas a través de la membrana interna mediante el sistema Sec82. Por lo tanto, las enzimas abandonan el citoplasma en forma desplegada, y su plegamiento final y adquisición de Zn(II) tienen lugar en el espacio periplasmático. Dado que el periplasma carece de mecanismos activos capaces de mantener la homeostasis de Zn(II), las concentraciones disponibles para las MBLs estarían ligadas a los niveles extracelulares del mismo. Para metales como el cobre, se han identificado metalochaperonas que captan los iones metálicos y los entregan de forma específica a sus proteínas diana, pero hasta el momento no han sido descriptas metalochaperonas de Zn(II).
La influencia de la composición del medio extracelular sobre la capacidad de MBLs periplasmáticas de captar iones metálicos fue demostrada en estudios con la enzima L1 de subclase B335. La expresión de L1 en periplasma utilizando medio rico LB o medio mínimo con Zn(II) agregado dio lugar a proteína unida a Zn(II), y con un contenido metálico cercano al máximo esperado de 2 equivalentes de este ion por molécula de proteína. Sin embargo, cuando se utilizó medio mínimo suplementado con otros metales como Fe(II) o Mn(II) la enzima obtenida incorporó metal de forma
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heterogénea, y parte de los sitios metálicos en la población unieron estos iones mientras que una proporción incorporó Zn(II). Mientras tanto, la proteína producida en medio mínimo sin metales agregados incorporó tanto Zn(II) como Fe(II) pero con un pobre contenido metálico total, inferior a 1 equivalente por molécula de proteína.
Las MBLs se encuentran optimizadas para captar Zn(II) en el espacio periplasmático, mediante adaptaciones para incrementar su afinidad por este ion, como demuestran una serie de trabajos realizados en el laboratorio donde se llevó a cabo este trabajo de tesis. Las enzimas de subclase B1 poseen una cisteína como ligando de uno de los Zn(II) del sitio activo, mientras que las enzimas de la superfamilia de las MBL poseen típicamente un residuo de ácido aspártico en esa posición31. La presencia de cisteína como ligando metálico resultaba llamativa en proteínas periplasmáticas, dada las características oxidantes de este compartimiento celular, y que la oxidación de este residuo impide la unión de Zn(II). Además, la caracterización in vitro del mutante BcII C221D, en el que se reemplazó esta posición por el residuo conservado en la superfamilia, demostró que la enzima purificada podía hidrolizar antibióticos con eficiencia comparable a la variante silvestre100, de forma similar a lo observado previamente para el mutante C221D de IMP-1. A pesar de ello, el mutante C221D otorgaba niveles de resistencia mucho menores a E. coli frente β-lactámicos, aunque se restauraba su función con la adición de exceso de Zn(II) al medio de crecimiento. La determinación de las afinidades de unión a metal de la proteína salvaje y el mutante demostraron que la sustitución C221D reduce apreciablemente la capacidad de la enzima de captar Zn(II)100. Los altos niveles de Zn(II) presentes en los ensayos in vitro permiten a BcII C221D funcionar correctamente, mientras que esta no puede adquirir el metal necesario bajo la menor disponibilidad del mismo en el periplasma. Por ello, se concluyó que la selección natural favoreció la presencia de una cisteína en esa posición, asegurando la formación de una especie bimetálica y la supervivencia de la bacteria productora.
Un fenómeno similar fue observado para SPM-1 mediante el análisis de mutantes resultantes de aleatorización de posiciones próximas al sitio activo de la enzima101. El mutante G121A de SPM-1 demostró una capacidad equivalente a la enzima salvaje de hidrolizar sustratos en condiciones de elevada disponibilidad de Zn(II), pero su capacidad de otorgar resistencia se vio notablemente disminuida en presencia de compuestos quelantes de metal en el medio extracelular. Posiblemente la presión de selección actuante sobre la enzima determinó la fijación de un residuo de glicina en esta posición para permitir el funcionamiento de la enzima en condiciones de pobre disponibilidad del metal.
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Estudios de evolución dirigida también pusieron en relevancia la importancia de la unión a Zn(II) para las MBLs. La selección de variantes de BcII con resistencia aumentada frente al sustrato pobremente hidrolizado cefalexina dio lugar a un mutante denominado M5102, con una mejora de 32 veces en la CIM (concentración inhibitoria mínima). De las cuatro mutaciones presentes en M5, la sustitución G262S era responsable de la mayor parte del incremento en la tasa de hidrólisis del sustrato para la enzima pura. Sin embargo, la resistencia conferida a E. coli no se condecía con la caracterización in vitro, y eran necesarias las demás mutaciones para llegar a la máxima CIM, conferida por M534. Se encontró que la mutación G262S reducía la afinidad por Zn(II) de la enzima, y que otra sustitución, N70S, compensaba su efecto en M5. En concordancia con ello, la adición de un exceso de Zn(II) al medio de crecimiento incrementaba marcadamente la resistencia otorgada por el mutante G262S pero no en M5, demostrando que las dificultades en la adquisición de metal in vivo condicionaban el funcionamiento de este primer mutante.