Spatio-Temporal Inter-Object Constraints

Existen numerosos ensayos clínicos para detectar la presencia de organismos productores de β-lactamasas o carbapenemasas20_{. Algunos de ellos se basan en la} detección rápida y altamente sensible de los genes responsables de la producción de estas enzimas, utilizando reacciones de PCR con oligonucleótidos específicos para las clases de mayor prevalencia clínica. En años recientes también se ha avanzado en el desarrollo de métodos para identificar a productores de β-lactamasas a partir de análisis por espectrometría de masa.

Además de estos ensayos que detectan de forma directa la presencia del gen o la proteína responsables de la resistencia, existen tests fenotípicos basados en la detección de la actividad β-lactamasa. Entre ellos se encuentra el método Carba-NP, en el cual una muestra del aislamiento a ensayar se suspende en un medio que contiene un carbapenem y un indicador de pH. La hidrólisis del antibiótico libera H+ _{que a su vez} producen el viraje del indicador, por lo que la presencia de una carbapenemasa se evidencia como un cambio de color del medio de ensayo.

El test de Hodge modificado (MHT) es un test fenotípico para identificar productores de carbapenemasas, recomendado por el CLSI (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio de EE UU) para aislamientos clínicos de Enterobacterias con CIMs elevadas contra estos antibióticos. Para llevar a cabo este ensayo, se esparce en la superficie de una placa una cepa indicadora, sensible a carbapenemes, de modo que generaría un pasto bacteriano en ausencia del antibiótico. En el centro de la placa se ubica un disco de papel conteniendo un carbapenem, y se realizan estrías desde el

61

borde de la placa hacia el centro con los aislamientos que se desea analizar. Luego de incubar para permitir el crecimiento bacteriano, las estrías correspondientes a las cepas resistentes a carbapenemes habrán crecido hasta proximidades del disco central que contiene el antibiótico, mientras que la cepa indicadora presentará una amplia zona de inhibición alrededor del mismo (Figura 19-a). Las cepas productoras de carbapenemasas liberarán parte de las enzimas al medio circundante produciendo la degradación del antibiótico, lo que permite que el crecimiento de la cepa sensible se aproxime más al disco central a lo largo de las estrías correspondientes a dichos aislamientos que en las zonas alejadas de las mismas. El crecimiento de la cepa indicadora permitido por la protección conferida por la carbapenemasa permite diferenciar a los productores de estas enzimas de aislamientos cuya resistencia se debe a otros mecanismos, como deleción de porinas o sistemas de eflujo.

El MHT tiene una alta sensibilidad para la detección de las carbapenemasas de clase A y D, pero presentaba una sensibilidad reducida para la detección de NDM-1, inferior al 50%114_{. Existía la posibilidad de que la localización en membrana de esta} enzima impidiera su liberación desde las células y por lo tanto fuera el origen de la alta tasa de falsos negativos en el test. En colaboración con investigadores del Instituto Malbrán (Buenos Aires, Argentina) se buscó determinar el efecto del anclaje a membrana sobre la detección de MBLs mediante el MHT114_.

Se evaluó en primer lugar la localización subcelular de NDM-1 en un conjunto de aislamientos clínicos productores de la enzima: Providencia rettgeri 15758, Serratia marcescens 17468 y Enterobacter cloacae 17464. Se sonicaron células de estos organismos obteniendo un homogenado (H) que luego fue ultracentrifugado para separar proteínas solubles (S) de aquellas de membrana (M). Al analizar estas muestras mediante western blot con anticuerpos Anti-NDM se comprobó que, al igual que en las cepas de laboratorio previamente caracterizadas, la enzima se halla completamente ancla a membrana en estos aislamientos clínicos (Figura 18). P. rettgeri presentó menores niveles de expresión totales por lo que para evaluar la localización fue necesario aumentar el tiempo de revelado para tener mayor sensibilidad en la detección.

62

Figura 18. a) Análisis mediante western blot de fracciones de homogenado total (H), membranas (M) y

proteínas solubles (S) obtenidas de E. coli DH5α pMBLe-blaNDM-1 y aislamientos clínicos productores de

NDM-1. b) Detección extendida mediante western blot de las muestras provenientes de P. rettgeri para

incrementar la sensibilidad. Adaptado de Pasterán et al., J Clin Microbiol, 2016114_.

Se analizó la respuesta de E. coli DH5α productoras de NDM-1, NDM-1 C26A, V- NDM, VIM-2 o N-VIM en el test MHT, observándose claramente que las bacterias que expresaban MBLs ancladas a membrana (NDM-1 y N-VIM) daban lugar a falsos negativos en el test, mientras que aquellas que producían las correspondientes variantes solubles (NDM-1 C26A, V-NDM y VIM-2) sí permitían el crecimiento de la cepa indicadora de acuerdo a lo esperado para un productor de carbapenemasas (Figura 19-a). En base a esto, y a las observaciones de que el detergente no-iónico Tritón X-100 es capaz de solubilizar a NDM-1 a partir de las membranas bacterianas manteniendo su actividad lactamasa, los investigadores del Instituto Malbrán desarrollaron una modificación del MHT, en el cual se adiciona al medio de crecimiento este detergente para ayudar a la liberación de las MBLs ancladas a membrana. Esta variación del test se denominó Tritón Hodge Test (THT), y al ser aplicado a las cepas E. coli DH5α productoras del conjunto de MBLs antes mencionado demostró su capacidad de revertir los falsos negativos previamente observados para aquellas que producían enzimas ancladas a membrana (Figura 19-b).

63

Figura 19. Resultados del test de Hodge Modificado (MHT) (a) y del Tritón Hodge Test (THT) (b) para

cepas de E. coli DH5α productoras de NDM-1, NDM-1 C26A, V-NDM, VIM-2 y N-VIM. Se utilizó como

cepa control no productora de carbapenemasas E. coli DH5α portando el plásmido pMBLe vacío. Como

antibiótico se empleó un disco con 10 µg de meropenem. Los resultados del test para cada cepa se indican a lo largo de la estría correspondiente a cada una como positivo (p) o negativo (n) de acuerdo a la capacidad

de la misma de permitir el crecimiento de la cepa indicadora sensible a carbapenemes (E. coli ATCC

25922) sembrada en toda la placa. Adaptado de Pasterán et al., J Clin Microbiol, 2016114_.

La evaluación del funcionamiento del THT versus el MHT con un panel de aislamientos clínicos productores de NDM-1 y otras carbapenemasas demostró una amplia mejora en las tasas de detección de NDM-1 (92,5-100% dependiendo del carbapenem utilizado para el test) en el test THT respecto a los pobres resultados observados para MHT (20-32,5%)114_{. Estas mejoras se obtuvieron además sin afectar la} detección de otras MBLs o carbapenemasas del tipo SBL, y sin incrementar la tasa de falsos positivos en organismos resistentes a carbapenemes sin producción de carbapenemasas. Se propuso por lo tanto al THT como una alternativa superadora a la utilización del MHT para detección de carbapenemasas114_.

64