Descripción y fundamento:
La Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas (LC-MS) está ganando aceptación progresivamente en éste área, ya que presenta interesantes ventajas sobre la Cromatografía Gaseosa, para la evaluación de los Procesos de Oxidación Avanzada (AOPs): (i) el análisis directo de las muestras acuosas evita la pérdida de PDs polares durante el proceso de extracción; (ii) compuestos altamente polares, menos volátiles y/o térmicamente lábiles son analizados con más facilidad que utilizando técnicas de cromatografía gaseosa; y (iii) el proceso de inyección es muy restrictivo respecto a GC.
En la realización de esta tesis doctoral, las dos interfases utilizadas en los equipos LC- MS están comprendidas en la tecnología de Ionización a Presión Atmosférica (API). Se trata de Electrospray (ES) e Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI). La interfase ES es un sistema de ionización en el que cualquier ión que esté en disolución se puede detectar, incluido las macromoléculas, sales, etc. Esta detección puede realizarse en cualquier rango de polaridades. Además la posibilidad de obtener iones múltiplemente cargados hace que su utilidad sea aplicable a todas las áreas, incluida la de identificación de compuestos desconocidos como los PDs de los procesos fotocatalíticos. La interfase APCI es aplicable en un rango de polaridades menor que en ES y el rendimiento de la ionización también es menor, luego es menos sensible. Sin embargo, en ES debido a su forma particular de ionización (que se explica a continuación) pueden aparecer asociaciones o aduptos de moléculas (dímeros, etc.), que en APCI se evita gracias al calentamiento de la muestra ya que la ionización es más enérgica. Para poder detectar el ión molecular [M+1] de un compuesto desconocido se utiliza el espectro obtenido con APCI pues en ES el pico de mayor peso puede ser un adupto. Por ejemplo, en ES puede aparecer el ión [M+23], es decir [M+Na] ya que el metanol suele tener impurezas de sodio.
En la figura 2.3.8 se ilustran los rangos de aplicación de los diferentes métodos de acoplamiento de la cromatografía líquida con la espectrometría de masas en función de las masas y la naturaleza de los compuestos a determinar. En ella se puede observar el gran rango de aplicación que se cubre con la utilización conjunta de las interfases ES y APCI en LC-MS.
APCI es una técnica de ionización química que usa reacciones ión-molécula en fase gas a presión atmosférica con la participación del disolvente. Los iones primarios se producen en la corona de descarga (ver figura 2.3.9.a). El eluente cromatográfico se introduce directamente en un nebulizador neumático, donde es convertido en una fina niebla gracias a una corriente a alta velocidad de aire o de partículas de nitrógeno. Las gotas formadas se exponen, a través de un tubo de cuarzo, a un calentamiento cuidadosamente controlado, conocido como cámara de desolvatación / vaporización. El gas caliente (120º C) y los compuestos que salen del tubo y llegan al área de reacción de la fuente son ionizados bajo presión atmosférica vía transferencia de protones. La fase móvil evaporada actúa como gas ionizante y produce iones [M+H]+. Los electrones necesarios para la ionización primaria provienen de la corona de descarga. La descomposición térmica es llevada al mínimo y la ionización de los analitos es muy efectiva.
Figura 2.3.8. Diagrama de los rangos de aplicación de los distintos sistemas de acoplamientos
LC-MS.
El ES se produce por aplicación de un campo eléctrico fuerte, a presión atmosférica, del eluente líquido que pasa a través de un capilar a un flujo suave (1-10 μL/min.). El campo eléctrico es obtenido por aplicación de una diferencia de potencial de 3-6 kV entre el tubo capilar y el electrodo contrario, los cuales están separados 0.2-0.3 cm (ver figura 2.3.9.b). Este
campo induce una acumulación de carga en la superficie del líquido que está al final del capilar, el cual se rompe formando gotas altamente cargadas. Como el disolvente contenido en estas gotas se evapora, estas se encogen hasta el punto que las fuerzas de repulsión culombimétricas superan sus fuerzas de cohesión, causando así su explosión. Eventualmente, después de una cascada de explosiones adicionales los iones altamente cargados se desorben. ES puede ser usado con moléculas no ionizables gracias a la formación de aduptos de sodio, potasio, amonio y otros. El espectro de masas de ES normalmente muestra una distribución estadística de iones moleculares múltiplemente cargados por protonación [M+nH]n+, además de evitar la contribución de disociaciones o de fragmentaciones.
Figura 2.3.9.a. Representación esquemática de una interfase APCI.
Reactivos, material e instrumentación:
- Sistema completo de SPE, descrito con detalle en el apartado 2.2.1.
- Acetonitrilo y Metanol calidad cromatográfica de Merck utilizados para elaborar la fase móvil del cromatógrafo líquido.
- Agua ultra pura procedente de un sistema Milli-Q utilizada también para la fase móvil del equipo.
- Viales de 2 mL del muestreador automático Agilent Technologies serie 1100.
- Sistema LC-Q-ES-MS: Cromatografo de Líquidos Agilent serie 1100 (Palo Alto, California, USA) compuesto por: desgasificador, bomba binaria, inyector automático y cámara termostatizada para la columna cromatográfica. Detector UV de longitud de onda variable Agilent G1314A. Detector de Masas con analizador de cuadrupolo Agilent serie 1100 G1946A, equipado con cámara de ionización de electrospray (ES). Software para el funcionamiento y trabajo posterior con los datos generados, Agilent Chemstation Rev. A.08.03.
Figura 2.3.9.b. Representación esquemática de una interfase ES.
- Sistema LC-IT-MS: Cromatógrafo de Líquidos Agilent serie 1100 (Palo Alto, California, USA) compuesto por: desgasificador, bomba binaria, inyector automático y cámara termostatizada para la columna cromatográfica. Detector UV de longitud de onda variable Agilent G1314A. Detector de Masas con analizador de trampa de iones Agilent serie 1100 G2445A, equipado con cámaras de ionización de electrospray (ES) e ionización química a presión atmosférica (APCI). El Software para el funcionamiento del cromatógrafo es el Agilent Chemstation Rev.A08.03. El detector
de masas se controla a través del software suministrado por Bruker Daltonics, MSD- Trap 4.0. Los cromatogramas y espectros de masas resultantes son tratados mediante el software de Bruker Daltonics, DataAnalysis Versión 2.0. En la Figura 2.3.4.1 se muestra una fotografía de uno de los dos equipos LC-MS empleados.
- Estándares cromatográficos de los compuestos identificados, de los que están disponibles en el mercado.
Figura 2.3.10. Fotografía del LC-MS instalado en los servicios técnicos de la Universidad de
Almería.
Procedimiento:
1º.- Preparación del equipo cromatográfico: Se selecciona la columna analítica y la precolumna más adecuados para cada experiencia. Normalmente se ha usado una columna C8 o C18. Se pone a punto la fase móvil según el compuesto elegido para los procesos de degradación fotocatalítica estudiados. Se selecciona la longitud de onda característica a las que absorben los compuestos de interés.
2º.- Preparación de Espectrómetro de Masas: Para la utilización del modo de ionización de Electrospray positivo los parámetros a ajustar son: la presión del nebulizador, la temperatura y flujo del gas de secado (N2) el voltaje del capilar y el voltaje de fragmentación (diferencia de potencial entre la salida del capilar y un skimmer). En el caso del analizador de trampa de
iones de iones se tendrán en cuenta otros parámetros adicionales como son: el ión que se va a aislar (m/z), la ventana de aislamiento (m/z), y el voltaje de fragmentación (V). El calibrado de los equipos tanto en el caso del cuadrupolo como en el de la trampa de iones se realiza mediante el software de control de los mismos, Chemstation en el caso del cuadrupolo y MSD-Trap en el de la trampa de iones.
En la utilización de la ionización Química a presión Atmosférica, APCI, los parámetros de control son la temperatura del vaporizador, intensidad de la corona de descarga, además de los mencionados para Electrospray.
3º.- Inyección de las muestras: Se realiza de forma automática la secuencia de inyección, en la que se especifica, entre otros: el número de inyecciones por muestra, el volumen de inyección, el método analítico a aplicar, etc. Se colocan los viales con las muestras en la bandeja de inyección y se inicia la secuencia. A veces es necesario realizar varias secuencias modificando los distintos parámetros que pueden afectar a la fragmentación de las moléculas presentes, obteniendo así mayor información sobre los Productos de Degradación, PDs, y poder llevar a cabo una identificación más fehaciente de su estructura.
Evaluación de los resultados:
Con ayuda del programa informático también, se procesan los cromatogramas analizando los espectros de masas de cada uno de los picos. La identificación de los compuestos desconocidos se realiza por elucidación estructural, mediante el estudio de los distintos fragmentos que aparecen en los espectros de masas de cada pico cromatográfico y sus abundancias relativas. Se identifican así los PDs resultantes de la aplicación de los tratamientos fotocatalíticos con Foto-Fenton y con TiO2 de los contaminantes orgánicos sometidos a estudio.
La cuantificación de estos compuestos se realiza por calibración utilizando los estándares de los compuestos identificados, si existen y están disponibles comercialmente. En LC-Q-ES-MS se selecciona un ión para cada pico cromatográfico, es decir para cada compuesto a determinar, que normalmente suele ser el pico base de su espectro de masas. A continuación, se integra este pico calculando su área y se calibra el compuesto con respecto a ese ión seleccionado. Cuando el pico base del compuesto aparece solapado con la matriz se
selecciona otro ión que tenga una abundancia relativa alta, para tener la máxima selectividad posible. Cuando se trabaja con LC-IT-MS, el método de cuantificación es parecido. Se extrae un ión, que también suele ser el pico base del espectro de masas, y se cuantifica de igual forma con respecto a él. Pero cuando este pico esta solapado con la matriz se fragmenta este ión y se cuantifica con respecto a los picos obtenidos. Estos sistemas con “trampa de iones” permiten seleccionar varios iones para realizar la cuantificación, que suelen ser el pico base más otros 3- 5 iones más, con lo cual se tiene mayor selectividad y se pueden evitar problemas de interferencias.