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Respecto a las actividades metabólicas “in vitro” de las dos cepas probióticas parece interesante resaltar la presencia en las mismas de las actividades catalasa y lipasa
(PROBIO 3). Ambas actividades tienen relación con la prevención de la peroxidación
lipídica y la absorción de lípidos respectivamente, características éstas que podrían contribuir al mantenimiento de una adecuada estructura celular e implementar el metabolismo de los ejemplares en cultivo (Ando et al., 1992; Koven et al., 1994). Además Pdp11 presenta un número significativo de diferentes actividades arilamidasa, características de esta cepa, que parecen promover una mayor absorción y digestión proteica de la dieta administrada (PROBIO 4). Resaltar que estos enzimas hidrolizan los aminoácidos terminales en péptidos y polipéptidos participando directamente en la regulación a hormonas y péptidos biológicamente activos en tejidos animales (Ramírez- Expósito et al., 2002).
En cuanto a la capacidad inhibitoria “in vitro” frente a patógenos de lenguado, se encontraron diferencias entre ambas cepas (PROBIO 3). En este sentido, Pdp11, tanto en fresco como en sus productos extracelulares (ECPs), presentó una respuesta positiva frente a P. damselae subsp. piscicida, inhibiéndose esta respuesta cuando los ECPs fueron inactivados por calor. Este hecho demostró el carácter termolábil de las sustancias inhibidoras frente al patógeno, lo que no supuso descartar en los ECPs la presencia de bacteriocinas. Asimismo se produjo inhibición frente a P. damselae subsp.
piscicida con la cepa Pdp11 liofilizada y con su extracto, lo que indicó la actuación no
sólo de las bacterias que permanecen viables en el liofilizado, sino también la de sustancias inhibidoras presentes en dicho liófilo. La respuesta de Pdp13 frente a P.
damselae subsp. piscicida fue, sin embargo, menor que para Pdp11. Pdp13 presentó una
intensidad débil o nula tanto con la cepa fresca, liofilizada o los ECPs y ECPs inactivados. También frente al patógeno V. harveyi Pdp11 mostró mayor inhibición que Pdp13 en todos los casos. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Chabrillón
et al. (2003) y sugieren la selección de Pdp11 como la mejor candidata para su futura
utilización probiótica. Añadir asimismo que la capacidad inhibitoria “in vitro” frente a patógenos ha sido descrita por diferentes autores en distintas cepas de Bacillus sp., en las que se aislaron compuestos volátiles (Yilmaz et al., 2006) y polipéptidos de carácter antibiótico activos frente a una gran variedad de bacterias Gram + y Gram- (Morikawa
et al., 1993).
Respecto a los análisis bioquímicos de Pdp11 y Pdp13 realizados en este ensayo
(PROBIO 3) se observó una composición proximal similar en proteínas, aunque Pdp13
presentó un nivel significativamente mayor de lípidos en comparación con Pdp11. En cuanto al perfil de ácidos grasos, ambas cepas probióticas presentaron un alto contenido de MUFAs (>62,0%), sobre todo de los ácidos grasos miristoleico (14:1), palmitoleico (16:1n-7) y margaroleico (17:1). Resulta interesante observar que si bien Pdp11 tuvo los niveles mayores de MUFAs, no fue así en el caso del ácido 16:1n-11, dado que Pdp13 alcanzó valores 65 veces superiores a los obtenidos en Pdp11. Esta diferencia detectada precisa un mayor estudio, pues se ha descrito una mayor resistencia a pH ácido (pH 2) por Lactobacillus casei ATCC 334. relacionada con elevados niveles de algunos ácidos grasos similares, como C16:1n(9), (Broadbent et al., 2010). Esta
característica puede ser de enorme interés en cuanto a favorecer la actividad bacteriana en el tracto gastrointestinal de los ejemplares. Además estos autores registraron niveles elevados de histidina intracelular que relacionaron por primera vez con la resistencia bacteriana a condiciones de pH ácido. Dado que este aminoácido esencial es un precursor de la histamina, podría tener además una función de mantenimiento de los tejidos más saludable. Los contenidos en PUFAs fueron bajos (aprox. 5,6%), siendo el nivel de EPA y ARA similar en ambos probióticos, aunque sólo Pdp11 presentó contenido en DHA. Otras diferencias registradas entre ambas cepas fueron el menor contenido de los ácidos grasos linoléico (18:2n-6) y linolénico (18:3n-3) y el mayor de ácido pentadecanoico (15:0) en Pdp13 frente a Pdp11. Ambas cepas presentaron un nivel importante de SAFAs (>28%), especialmente los de cadena corta y media, láurico (12:0), mirístico (14:0), pentadecanóico (15:0) y palmítico (16:0), de alguno de los cuales se han descrito propiedades antimicrobianas (Pérez-Gutiérrez, 2005; Pagkalos et
al., 2009). Resaltar que Pérez-Gutierrez (2005) detectó la presencia de diferentes ácidos
grasos de cadena corta y media con propiedades antimicrobianas (esteárico 18:0, linolénico 18:3n-3, margárico 17:0 y laúrico 12:0 entre otros) en Tubifex tubifex,
oligoqueto habitual de aguas con abundante materia orgánica en descomposición. Asimismo, esta autora determinó que los ácidos grasos demostrados más activos frente contra microorganismos GRAM+ y GRAM- fueron el ácido esteárico y el ácido linolénico. Decir que en nuestros ensayos no fue posible la determinación del contenido en ácidos grasos de cadena presentes en Pdp11 y Pdp13 debido a las características del cromatógrafo utilizado y a la ausencia de patrones específicos. Dichos ácidos grasos podrían estar relacionados con la capacidad de protección frente a patógenos que confieren los dos probióticos ensayados. Es por ello necesario estudiar en el futuro el contenido de ácidos grasos de cadena corta en Pdp11 y Pdp13. En este sentido, resulta interesante destacar que en la microbiota digestiva de ejemplares de lenguado senegalés salvajes o alimentados con poliquetos marinos, organismos cercanos a los estudiados por Pérez-Gutierrez (2005) se ha encontrado Shewanella sp. (Makridis et al., 2004; Martín-Antonio et al., 2007). La adición de las cepas Pdp11 y Pdp13 ensayadas en dieta estarían promoviendo las defensas naturales del lenguado senegalés.