Los experimentos mostrados sugieren que podría existir en el gen c-myc un control de la elongación transcripcional mediado por CDK9 similar al descrito para los genes del VIH-1. Estudios previos habían demostrado que CDK9 está presente no sólo en complejos de elongación (Mancebo et al. 1997; Wei et al. 1998) sino que se asocia a los PICs que se ensamblan en la región promotora del VIH-1 (Ping et al. 1999; Zhou et al. 2001). Debido a ello, nos propusimos examinar si CDK9 se asocia también con los PICs que se forman sobre el promotor del gen c-myc. Para tal fin, pusimos a punto un sistema de aislamiento de complejos transcripcionales in vitro para poder analizar así sus componentes. La metodología elegida se basa en la utilización de moldes de DNA que incluyen en su secuencia las regiones promotoras de los genes en estudio y que son sintetizados por PCR con oligonucleótidos modificados mediante la adición de biotina en su extremo 5´ (ver Materiales y Métodos). Tras la incubación de dichos moldes con el extracto nuclear, la presencia de biotina permite su inmovilización en resinas de estreptavidina y el aislamiento de los PICs, cuya composición proteica se analiza posteriormente mediante técnicas de WB (Figura 20).
Antes del análisis bioquímico y para comprobar la funcionalidad de los PICs, se realizaron experimentos de transcripción-elongación in vitro con PICs aislados de moldes biotinilados de DNA conteniendo, además de las regiones promotoras, las secuencias de los cassettes dGless. (Figura 19). Así, tras el aislamiento de los PICs del extracto nuclear y una vez lavados, se adicionaron los ribonucleótidos (uno de ellos marcado radioactivamente) en condiciones de transcripción, y se procedió al análisis de los tránscritos generados tal y como se describió previamente en el apartado 1.1 de esta sección. El análisis de los RNAs resultantes reveló que los PICs aislados según la metodología descrita eran funcionales y capaces de sintetizar tránscritos de una manera eficiente y, por tanto, que los PICs así aislados contenían todos los factores requeridos para transcribir ese DNA (Figura 19B).
Figura 19. Análisis de la funcionalidad de los PICs aislados in vitro. A) Esquema del procedimiento utilizado para el aislamiento de los PICs y posterior ensayo de actividad transcripcional. Se incuban los moldes biotinilados con el extracto nuclear (HeLa NE) y se aíslan utilizando una matriz magnética. Tras el lavado, se incuban con nucleótidos, uno de ellos marcado radiactivamente (32P-UTP). Los RNAs obtenidos se procesan tal y como esquematiza en la Figura 11. B) Reacciones de transcripción-elongación in vitro utilizando los moldes biotinilados conteniendo las regiones promotoras del VIH-1 y c-myc usadas, b-HIVcassette y b- P2cassette. En la figura se muestran dos reacciones independientes utilizando en cada caso los moldes indicados. Las flechas indican la migración de los tránscritos largos y cortos. Los marcadores (M) utilizados están descritos en la Figura 11.
La caracterización bioquímica de los PICs por WB se muestra en la Figura 20. Como era de esperar, las proteínas CDK9 y Ciclina T1 se detectaron en los complejos formados sobre el promotor del VIH-1 (Figura 20, carril 3) y sobre el promotor P2 del gen c-myc. (Figura 20, carril 5). Como control del experimento se analizó la presencia de TBP (proteína de unión a la caja TATA) y del factor de transcripción Sp1. Ambos promotores contienen una caja TATA consenso y tres sitios de unión al DNA para el factor Sp1 en el promotor del VIH-1 y una única caja rica en CT, identificada como sitio de unión para Sp1, en el promotor del gen c-myc (DesJardins et al. 1993; Majello et al. 1995). Tanto TBP como Sp1 se detectaron en los complejos formados sobre ambos
Figura 20. Análisis de la composición proteica de los PICs formados sobre los promotores del VIH-1 y c-myc. A) Esquema del molde biotinilado y el procedimiento utilizado para el aislamiento de los PICs. C) Se formaron los PICs utilizando los siguientes moldes biotinilados: 1- molde derivado del VIH-1 en ausencia de promotor (b-HIVPless), 2- molde del VIH-1 (b- HIV-1), 3- molde derivado de c-myc en ausencia de promotor (b-P2Pless), 4- b-TdT y 5- molde del VIH-1 sustituyendo la secuencia TATAA por GTCAC (b-HIVTATAm). Las proteínas aisladas se analizaron por WB utilizando los anticuerpos específicos para la localización de las proteínas indicadas. NE, extracto nuclear de células HeLa.
promotores (Figura 20), y aunque el ensayo no es cuantitativo, la reproducible intensidad de señal obtenida para la unión de Sp1 se correlaciona con el número de secuencias de unión a DNA presentes en ambos promotores. También se analizaron los PICs purificados con anticuerpos específicos para la RNAPII. Los resultados obtenidos son similares a los de TBP, sin embargo, la calidad de los anticuerpos utilizados no permitió obtener una señal de calidad aceptable. La especificidad de los PICs formados se examinó utilizando además construcciones de DNA que no contenían las secuencias promotoras (Pless), una construcción con la secuencia de la caja TATA mutada (b- HIVTATAm), y una construcción donde se sustituyó el promotor del VIH por la región promotora del gen de la deoxinucleotidiltransferasa terminal murina (b-TdT). El promotor TdT carece de la secuencia TATA y contiene únicamente un elemento iniciador que dirige la transcripción (Smale et al. 1989; Berkhout et al. 1992).
Corroborando la especificidad del sistema empleado, la señal obtenida para la proteína TBP en todas esas construcciones fue mínima, sin embargo, sí se observó la presencia del factor Sp1 en los PICs formados sobre el promotor HIVTATAm como era esperable ya que la secuencia de unión a DNA de ese factor sigue permaneciendo en ese molde de DNA. En dichos promotores se observó una menor asociación tanto de la proteína CDK9 como Ciclina T1 (Figura 20 carriles 6 y 7). Además, no se detectó la presencia de proteínas no implicadas en la formación de complejos transcripcionales, como la nucleolina o la quinasa CDK2 en los PICs purificados (Figura 20).
Estos resultados demuestran la presencia de P-TEFb en los complejos de la RNAPII ensamblados in vitro sobre los promotores del VIH-1 y c-myc, y sugieren el requerimiento de una secuencia TATA funcional para su reclutamiento.