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in vivo.

Los resultados obtenidos in vitro mostraban que el complejo P-TEFb está presente en los PICs formados en los promotores del VIH-1 y c-myc. Para conocer si el complejo P- TEFb es reclutado a las regiones promotoras de esos genes in vivo se llevaron a cabo experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Para estos experimentos se utilizó la línea celular Jurkat-(LTR-Tat-GFP)/clon8 que contiene una construcción integrada en el genoma celular conteniendo el LTR viral dirigiendo la expresión de las proteínas eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) y Tat. Esta línea celular exhibe un fenotipo de infección latente de forma que, en ausencia de estímulo, la producción de eGFP es menor del 10 % y se incrementa a más del 95 % después de la estimulación de la expresión génica por el éster de forbol PMA o TNF
(Dr E. Muñoz, Universidad de Córdoba, comunicación personal y (Marquez et al. 2008).

Para comprobar las condiciones en las que se producía la activación transcripcional del LTR viral integrado se realizó una estimulación de las células con PMA y se analizó la producción de eGFP y Tat por RT-PCR y WB. No se detectaron las proteínas eGFP y Tat en ausencia de inducción por PMA, sin embargo, después de la estimulación sí se detectaron ambas proteínas en los extractos así preparados (Figura 21B). Cuando se analizaron las muestras por RT-PCR se observó una baja señal de los mRNAs correspondientes a la eGFP y Tat en ausencia de estimulación (Figura 21C, carriles 1 y 4), indicando cierta actividad basal del promotor del LTR. Esta actividad transcripcional residual ha sido descrita en numerosos sistemas celulares inducibles.

Figura 21. Análisis de las estimulación con PMA de las células Jurkat-(LTR-Tat-GFP)/clon8. A) Representación esquemática de la construcción integrada en el genoma celular conteniendo el LTR viral 5´, las secuencias que codifican para las proteínas Tat y eGFP separadas por una secuencia IRES. B) Análisis por WB de los extractos preparados a partir de células sin tratar (-) o tratadas con 25 y 50 ng/μl de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) durante los tiempos indicados. La detección de las proteínas de interés se realizó mediante el uso de anticuerpos específicos. C) Análisis por RT-PCR del RNA obtenido a partir de células sin tratar (-) o tratadas con 25 y 50 ng/μl de PMA durante los tiempos indicados. La expresión de los genes de interés se indica a la derecha del panel.

El efecto de la estimulación por PMA del gen c-myc fue también estudiado. Los experimentos de RT-PCR mostraron una cierta reducción de los niveles del mRNA de c- myc a las 6 y 20 horas de la inducción, y prácticamente no se detectaron niveles de proteína después de las 20 horas de estimulación (Figura 21). La disminución observada de la expresión del gen c-myc en células Jurkat después de una estimulación con PMA ha sido ya descrita (Herrant et al. 2002).

Mediante ChIP se analizó la localización de las proteínas de interés en condiciones basales (ausencia de tratamiento con PMA), así como en células que habían sido sometidas a un tratamiento de estimulación con PMA y que por tanto presentaban una fuerte activación del LTR. En este tipo de ensayo, se somete a las células a un proceso de fijación para asegurar el aislamiento de fragmentos genómicos de interés mediante la inmunoprecipitación específica de los factores en estudio, para su posterior purificación

y detección mediante PCR (Figura 22). La puesta a punto de esta tecnología requirió el uso de diferentes protocolos de experimentación. En la Tesis se describe el protocolo de ChIP que mejores resultados dio con el sistema experimental usado (ver Materiales y Métodos).

Figura 22. Esquema del ensayo de ChIP. En azul y rojo se muestran dos proteínas diferentes, siendo la de color rojo la proteína de interés.

Dado que la proteína de estudio (CDK9) no se une directamente al DNA sino que requiere de interacciones proteína-proteína, la fijación se llevó a cabo con el agente dimetil 3,3´-ditiobispropionimidatox2HCl (DTBP) y formaldehído. Asimismo, se optimizaron las condiciones de lisis celular y sonicación (ver Materiales y Métodos y apartado 2.2 de esta sección) para asegurar la obtención de fragmentos de DNA genómico adecuados que permitieran delimitar de manera apropiada las distintas regiones del gen. Como se aprecia en la Figura 23, los fragmentos obtenidos tienen un tamaño reproducible de entre 100 y 500 pb .

Figura 23. Análisis de los fragmentos de DNA tras el protocolo de sonicación. Se muestra la electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % de 5 μg de DNA purificado de los extractos sonicados a partir de células sin tratar (DMSO) o tratadas con PMA. Se indica el tamaño en Kilobases (Kb) de los marcadores del tamaño utilizados (M1 y M2).

La cromatina se aisló de las células en ausencia o presencia del tratamiento con PMA y las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo con anticuerpos específicos para CDK9, la RNAPII (como control positivo) e inmunoglobulinas de conejo (rIgG) (como control negativo). La PCR se llevó a cabo con oligonucleótidos específicos para amplificar las regiones promotoras del LTR viral y del gen c-myc. Los resultados se muestran en la Figura 24 donde se observa la presencia específica de CDK9 y RNAPII en ambos promotores in vivo, tanto en células estimuladas como sin estimular. Sobre las mismas muestras inmunoprecipitadas se amplificaron dos fragmentos sobre los que cabía esperar un resultado negativo de asociación de la maquinaria transcripcional: una región intergénica situada 10 kb aguas arriba del gen c-myc, y una región exónica perteneciente al gen OCT-2, que se encuentra activo únicamente en linfocitos B (Bhargava et al. 1993; Marafioti et al. 2003). No se detectó la presencia de CDK9 o RNAPII en esas regiones, como se muestra en la Figura 24, lo que añade mayor especificidad a los resultados

Figura 24.Análisis por ChIP del reclutamiento de factores de transcripción a la región promotora del VIH-1 y c-myc. A) Esquema de la región integrada derivada del VIH-1 en las células Jurkat-(LTR-Tat-GFP)/clon8. B) Los extractos preparados a partir de células sin tratar (DMSO) o tratadas con 50 ng/μl de PMA y fijadas, se sonicaron y se inmunoprecipitaron con los anticuerpos indicados. Se purificó el DNA de las muestras y se analizaron los fragmentos obtenidos por PCR, amplificando las regiones correspondientes : la región promotora del gen c- myc endógeno, la región promotora del LTR viral integrado; una región intergénica 10 kb aguas arriba del promotor P2 del gen c-myc, y una región exónica del gen OCT-2. La señal INPUT (carriles 1 y 5) muestra la amplificación de los fragmentos correspondientes a partir de las muestras antes de la inmunoprecipitación.

obtenidos. Estos resultados indican que CDK9 se asocia a los complejos transcripcionales que se forman en la región promotora del gen c-myc, de la misma manera que en los complejos transcripcionales formados sobre el LTR del VIH-1 in vivo. Observamos una señal positiva tanto en el caso de células estimuladas y sin estimular, indicando un reclutamiento a dichas regiones en ausencia de activación transcripcional. Para examinar diferencias en las dos condiciones sería necesario analizar el DNA inmunoprecipitado de manera cuantitativa.

1.7. Relevancia de las secuencias de factores de unión a DNA en las regiones