Baseline outputs

extendía por debajo del plano de amputación hasta una distancia equivalente a un segmento esquelético del plano de amputación.

Durante la regeneración del corazón detectamos periostin desde 3dpa hasta 14dpa (Figura 17C). A 3dpa observábamos una expresión muy fuerte a lo largo de todo el epicardio que rodea las dos cámaras del corazón, así como en parte del coágulo sanguíneo. A

7dpa, la expresión se restringía a la zona de amputación y epicardio de ambas cámaras el dominio de expresión se restringía (Figura 17C). A 3dpa se detectaba en varias capas celulares, mientras que a 7dpa se observaba sólo en la más exterior. A 14 dpa el patrón de expresión de

periostin se mantenía, a la vez que se extendía

hacia en interior de la zona dañada (Figura 17C).

Otro de los genes relacionados con la

Figura 18. La transcripción del factor de crecimiento del tejido conectivo (connective tissue growth factor o ctgf) aumenta durante la regeneración de la aleta y del corazón. (A) Resultados del análisis de los microarrays. La transcripción de ctgf e aumenta tanto en la regeneración de la aleta como del corazón. Los cambios están expresados en base logarítmica. En todas los agrupamientos la escala colorimétrica empleada es la misma que en la Figura 12. (B) PCR cuantitativa de ctgf. Los niveles de transcripción están aumentados en todos los tiempos analizados. (C) Patrón de expresión de ctgf durante la regeneración de la aleta a 1, 2 y 3 dpa. Se expresa en el blastema a partir de las 24 hpa. (D) Patrón de expresión de ctgf durante la regeneración del corazón a 1, 3, 7 y 14 dpa.

Resultados

ECM que despertó nuestro interés fue el factor

de crecimiento del tejido conectivo (CTGF o CNN2). Ctgf es una proteína asociada a la

ECM que se une a integrinas, fibronectinas, proteoglicanos unidos a heparan-sulfato como los syndecans, proteínas relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 1 y 6 (LRP1 y LRP6) y el receptor tirosina kinasa del factor de crecimiento nervioso (TrkA) (Luft, 2008; Moussad and Brigstock, 2000). Ctgf juega un papel en angiogénesis, condrogénesis y reparación de heridas mediante su participación en proliferación, migración y diferenciación (Luft, 2008). Su expresión aumenta tras producirse una herida y esta implicado en la formación del tejido granuloso, re-epiteliarización y formación y remodelación de ECM en varios procesos fibróticos incluyendo el corazón (Barrientos et al., 2008; Daniels et al., 2009). En un trabajo muy similar al nuestro se ha descrito que los niveles del mensajero de ctgf aumentan durante la regeneración del corazón en el pez cebra (Lien et al., 2006).

Hemos validado mediante PCR cuantitativa e ISH los resultados del análisis de los microarrays (Figura 18A). La PCR cuantitativa mostró que al igual que con el microarray, los niveles de transcripción de ctgf estaban aumentados durante los procesos regenerativos (Figura 18A). Al analizar mediante ISH el patrón de expresión durante la regeneración de la aleta observamos que ctgf se expresaba desde 1 dpa. A 1dpa se expresaba en la zona del blastema por encima de los radios esqueléticos (Figura 18C). A 2dpa se expresaba por todo el blastema pero su expresión era más fuerte por debajo de la epidermis de la herida(Figura 18C). A 3dpa vimos que se expresaba en el blastema distal y en la zona interradial,en el tejido conectivo más cercano o en contacto con los radios esqueléticos (Figura 18C).

Durante la regeneración del corazón ctgf se expresaba a 1 dpa en células aisladas dispersas por todo el corazón, aunque se concentraban en mayor número en la zona de amputación (Figura 18D). A 3 dpa desaparecía casi por completo la expresión en células aisladas en el interior del ventrículo y pasaba a expresarse a por todo el

epicardio y en el endocardio más próximo al plano de amputación (Figura 18D). A 7dpa la expresión en el epicardio quedaba restringida a los márgenes de la zona de la herida y se seguían observando algunas células epicárdicas alejadas del plano de amputación. En la zona de la herida se expresaba, aparte de en células aisladas del endocardio y miocardio, también en células dentro del coágulo. Finalmente, a 14 dpa la expresión se restringía a la zona en regeneración, observándose en todos los tejidos implicados (Figura 18D). Este patrón de expresión nos recordó mucho a los anteriormente descritos para fn1b e itgα5.

El último de los genes relacionado con la ECM en el que centramos nuestra atención fue

keratina 18. Keratina 18 forma junto con keratina

8 los filamentos intermedios de los epitelios monoestratificados (Hutton et al., 1998). Se ha descrito que su transcripción aumenta en el pez cebra durante la regeneración de la aleta (Padhi et al., 2004) y durante la regeneración del nervio óptico (McCurley and Callard, 2010). También se ha demostrado su implicación e importancia durante la regeneración de la extremidad en tritón (Corcoran and Ferretti, 1997), donde la inyección de oligonucleótidos antisentido contra ella en células del blastema en cultivo induce cambios morfológicos y hace disminuir la síntesis de ADN.

Analizamos por PCR cuantitativa la transcripción de keratina 18 durante la regeneración de la aleta y del corazón (Figura 19B). Vimos que a 12 y 24 hpa su expresión estaba muy aumentada con respecto al control, tal y como habíamos visto en los resultados de los microarrays. Aunque posteriormente (2 y 3 dpa en el caso de la aleta y 3 y 7 dpa en el caso del corazón) su expresión disminuía, todavía estaba muy por encima de la transcripción basal que mostraban los controles. A continuación, analizamos su patrón de expresión durante ambos procesos mediante ISH. En la aleta,

keratina 18 se expresaba a 24hpa por toda la

zona regenerada (distal al plano de amputación) y en la zona interradial por debajo del plano de amputación (Figura 19C). Este patrón de expresión era muy similar al de fn1b e itgα5.

Resultados

A 2 dpa se expresaba en la zona del blastema distal y en la zona limite entre el blastema de los radios y la zona interradial. A 3dpa se mantenía la expresión se restringía a esta zona y a la parte distal del blastema (Figura 19C).

Durante la regeneración del corazón

keratina 18 se transcribía desde 1 dpa hasta

al menos 14 dpa. A 1dpa se expresaba en el endocardio más cercano a la zona amputada (Figura 19D). También por todo el endotelio (no pudimos determinar si se trataba de endocardio

o del endotelio de los vasos coronarios), en el endotelio del bulbo arterial y en el epicardio de la aurícula. A 3dpa desaparecía la expresión de

keratina 18 en el endocardio de la aurícula y en

endotelio del bulbo arterial, pero se expandía por todo el epicardio del ventrículo (Figura 19D). En el endocardio del ventrículo keratina

18 se restringía a la zona más cercana al plano

de amputación. También detectamos expresión en la parte más externa del coágulo. A 7 dpa disminuía mucho la expresión en el epicardio y Figura 19. La expresión de Keratina 18 aumenta durante la regeneración de la aleta y del corazón. (A) Cuadro donde se muestran los resultados del análisis de los microarrays. La transcripción de keratina 18 aumenta en todos los tiempos (expresado en base logarítmica). En todas los agrupamientos la escala colorimétrica empleada es la misma que en la Figura 12. (B) PCR cuantitativa de keratina 18. Al igual que en el microarray, su transcripción están aumentada en todos los tiempos analizados (12, 24, 48 y 72 hpa en el caso de las aletas y 12 hpa, 1, 3 y 7dpa en el caso de la regeneración del corazón). (C) Patrón de expresión de keratina 18 durante la regeneración de la aleta a 1, 2 y 3 dpa. (D) Patrón de expresión de keratina 18 durante la regeneración del corazón a 1, 3, 7 y 14 dpa (c=coagulo sanguíneo).

Resultados

se mantenía en la parte más externa del coágulo (Figura 19D). En el endocardio, únicamente se observaba expresión en la zona dañada. Finalmente a 14 dpa, que fue el tiempo más tardío que analizamos, keratina 18 se detectaba únicamente en el endocardio de la zona dañada (Figura 19D).

3.2 Genes relacionados con la

señalización celular: JunB , Hyou1,

raldh2, midkine-a y caveolina-1.

A continuación, quisimos validar algunos de los genes comunes a los dos procesos identificados en el microarray que estuviesen implicados en señalización.

Figura 20. La transcripción de junB y junB-like aumenta durante la regeneración de la aleta y del corazón . (A) Cuadro donde se representan los resultados del análisis de los microarrays. La transcripción de junB y junB-like aumentan durante la regeneración del corazón y de la aleta. Los cambios están expresados en base logarít- mica. En todas los agrupamientos la escala colorimétrica empleada es la misma que en la Figura 12. (B) PCR cuan- titativa de junB y junB-like durante la regeneración. La transcripción de ambos genes aumenta en todos los tiempos analizados (C) Patrón de expresión de junB durante la regeneración de la aleta a 1, 2 y 3 dpa. (D) Patrón de expresión de junB-like durante la regeneración del corazón a 1, 3, 7 y 14 dpa (c=coagulo sanguíneo).

Resultados