La solución de sales, elementos traza y suplementos utilizados en los medios de cultivo se describen en este apartado 1 de materiales y métodos. Los cultivos se incubaron a 37ºC, salvo indicación en contra, y con agitación orbital de 250 r.p.m. en el caso realizarse con medio líquido. Los cultivos en medio líquido se inocularon con 3x106 conidiosporas/mL. Los conidios se recolectaron rascando la superficie de las colonias con una espátula estéril y se resuspendieron en una solución acuosa de TWEEN 80 al 0,01% (v/v).
3.1.1.1.) Medio Mínimo de Aspergillus (MMA).
Para 1 litro de medio mínimo de Aspergillus (MMA) se diluyeron 20mL de solución de sales con agua Mili-Q y se ajustó el pH a 6,5 añadiendo una solución concentrada (10M) de NaOH. El medio se esterilizó en autoclave durante 20 minutos a 110ºC. Para preparar el medio mínimo sólido se añadió agar Oxoid al 1% (p/v) antes de su esterilización. Tanto al medio sólido como líquido, justo antes de ser utilizados, se añadieron los suplementos necesarios para el crecimiento de cada estirpe, así como la fuente principal de carbono y la de nitrógeno, generalmente D-glucosa 1% (p/v) y tartrato de amonio 5mM, respectivamente.
Para preparar medio de cultivo a pH ácido, se añadió NaH2PO4 a las
concentraciones finales de 50 ó 100 mM, según se indique en el experimento resultando en un valor de pH en el rango de 5-5,5. El medio de cultivo tamponado a pH alcalino se obtuvo añadiendo Na2HPO4 hasta una concentración final de 100 mM, resultando el pH
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del medio ajustado a valor a un valor aproximado de 8. El medio de cultivo a pH neutro se obtuvo mediante la adición de fosfato monosódico y fosfato disódico a una concentración final de 50 mM cada uno, resultando el valor final de pH en el medio de 6,5.
Para el análisis al microscopio de fluorescencia de las distintas estirpes, se utilizó una versión del MMA líquido denominada “watch minimal medium” (WMM) [99]. Para prevenir la formación de precipitados de sales que interfieren en microscopía, este medio carece de sales de fosfato antes de ser autoclavado y por lo tanto se suplementa con 25 mM NaH2PO4 antes de su utilización.
3.1.1.2.) Medio Mínimo de Aspergillus sin potasio (MMA-K+).
Se preparó este medio de la misma forma que el MMA, pero eliminando el potasio presente en la solución de sales (Ver composición solución sales en el apartado 3.1.1.5). Para compensar el balance iónico del medio se añadió sodio en lugar de potasio en esta solución, sustituyendo el KCl por NaCl y el KH2PO4 por NaH2PO4
manteniendo la molaridad.
3.1.1.3.) Medio completo de Aspergillus (MCA).
Composición por litro: 20mL de solución de sales, 10mL de solución de casaminoácidos, 10g de D-glucosa, 2g de bactopeptona y 1g de extracto de levadura. Se añadió agua hasta un litro y se ajustó el pH a 6,5 con una solución 10M de NaOH. Para el medio sólido se añadió agar al 1% (p/v). El medio de cultivo se esterilizó en autoclave durante 20 minutos a 110ºC. Antes de ser utilizado, se le añadió 10mL de solución de vitaminas/litro, la fuente principal de nitrógeno y, en caso de necesitarse,
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[39] los requerimientos adicionales específicos de cada estirpe ausentes de la solución de vitaminas.
3.1.1.4.) Medio de fermentación (MFA).
Este medio incluye como principal componente el CSL (Corn Steep Liquor). Se utilizaron los lotes Cerestar-2062 o Laisa-60015 a una concentración de 25 g/l. Antes de pesarse el CSL, se mezclaron bien las fases acuosa y sólida. Una vez pesado el CSL, se añadió el agua destilada y la solución de sales (20mL/l). Se agitó durante 20 minutos y se filtró a través de papel de filtro utilizando vacío. El pH se ajustó a valor 6,8 con NaOH (10M) y el medio se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 30 minutos. Posteriormente se le añadió como fuente de carbono principal 3% de sacarosa, como fuente de nitrógeno principal 5mM de tartrato de amonio y los suplementos específicos de cada estirpe.
3.1.1.5) Medio de regeneración (MMR)
En este medio se utilizan 20 mL de soluciones de sales y 342 g sacarosa (1M). Se añadió agua hasta un litro y se ajustó el pH a 6,8 con NaOH. Antes de esterilizar el medio en el autoclave se añadió agar Oxoid al 1,5%. En el momento que el medio fue utilizado se añadieron la D-glucosa 1%, el tartrato de amonio a 5mM y los suplementos necesarios para el crecimiento de las cepas.
3.1.1.6) Medio de regeneración-TOP (MMR-TOP)
En este medio se utilizan 20 mL de soluciones de sales y 342 g sacarosa (1M). Se añadió agua hasta un litro y se ajustó el pH a 6,8 con NaOH. Antes de esterilizar el medio en el autoclave se añadió agar Oxoid al 1,5%. En el momento que el medio fue
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utilizado se añadieron la D-glucosa 1%, el tartrato de amonio 5mM y los suplementos necesarios para el crecimiento de las cepas.
3.1.1.7) Soluciones y suplementos para medios de A. nidulans. - Solución de sales (solución concentrada 50x)
Para 1 litro:
KCl 26g MgSO4·7 H2O 26g
KH2PO4 76g
-Solución de elementos traza sin sales de fosfato (solución concentrada 1000x) Para 1 litro: Na2B4O7·10H2O 40 mg CuCl·2H2O 400 mg FeCl3 800 mg ZnCl2 8.000 mg MnCl2·4H2O 800 mg
-Solución de sales baja en concentración de fosfatos Para 1 litro (solución concentrada 50x):
KCl 26 g
MgSO4·7 H2O 26 g
KH2PO4 76 g
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[41] -Solución de casaminoácidos.
Hidrolizado de caseína 150g/l. Esterilizar en autoclave 110ºC, 20 minutos. Se utilizó como solución concentrada 10x.
-Solución de vitaminas*.
Para 1 litro (solución concentrada 100x): Tiamina……...…50 mg Biotina……...10 mg Ácido nicotínico……...…..100 mg Pantotenato de calcio…...200 mg Piridoxina-HCl………...…..50 mg Riboflavina…………..…...100 mg Ác. p-aminobenzoico (PABA)...100 mg Inositol...24.000 mg
* Esta solución se esterilizó mediante filtración y se guardo a 4ºC protegida de la luz. -Suplementos:
Se prepararon en agua a en una solución concentrada 100x, excepto para la biotina que fue de 10.000x.
Biotina: 100mg/l. Esterilizada por filtración.
Ácido p-aminobenzoico (PABA): 100mg/l. Autoclave, 20 minutos a 110ºC. Pantotenato de calcio: 200mg/l. Esterilizado por filtración.
Piridoxina-HCl (Vitamina B6): 5g/l. Esterilizada por filtración. Inositol: 1,2g/l. Esterilizado por filtración.
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