Se han recogido muestras de sangre sobre papel (Whatman y de filtro) de 104 individuos sanos y no emparentados de distintos núcleos poblacionales de la provincia de Jujuy. Todos los individuos eran voluntarios informados y sanos. Su linaje ha sido verificado mediante información biogeográfica comprobada hasta al menos la tercera generación; principalmente los lugares de nacimiento del donante, de sus padres y sus abuelos.
La muestra fue tomada por un equipo dirigido por el Dr. Dipierri (Universidad Nacional de Jujuy, Argentina) El ADN fue extraído de manchas de sangre en papel siguiendo el procedimiento estándar del fenol-cloroformo (Sambrook et al.,1989).
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Tabla M.2: Resumen del origen y el tipo de extracción / purificación del material genético.
Nombre de la muestra Origen Tipo de extracción / purificación
Vascos de Gipuzkoa Sangre periférica Extracción orgánica fenol-cloroformo Vascos de Navarra Sangre periférica Extracción orgánica fenol-cloroformo Residentes vascos Sangre periférica Extracción orgánica fenol-cloroformo
Gitanos vascos Saliva Qiagen
Valencianos Sangre en papel Extracción orgánica fenol-cloroformo
Afrodescendientes de Chocó Banco de ADN Banco ADN
Indígenas de Jujuy Sangre en papel Extracción orgánica fenol-cloroformo Waorani de Ecuador Sangre en papel Extracción orgánica fenol-cloroformo
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Marcadores y análisis molecular.
Para este proyecto de investigación se han estudiado el indel rs72377086, 4 microsatélites y diez SNPs; un total de 15 marcadores localizados en la región 17q21.31 que cubren algo más de 1 Mb de la misma, incluyendo la inversión del cromosoma 17 (figura M.1.).
Figura M.1.: Marcadores analizados.
Indel, PCR y electroforesis en gel de agarosa.
Se ha analizado el indel rs72377086 en todas las poblaciones del estudio. La presencia o ausencia del fragmento intrónico de 238 pb fue determinada mediante la visualización del producto de la PCR junto con un marcador de peso molecular en un gel de agarosa.
Amplificación por PCR y electroforesis en gel de agarosa.
La región seleccionada fue amplificada mediante PCR (Mullis et al, 1986) empleando los siguientes cebadores (Baker et al, 1999):
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F (5´-3´) GCA AGA CGT TCT CAC TGA TCT G R (5´-3´) AGG AGT CTG GCT TCA GTC TCT C
La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un volumen total de 10 l por muestra que contenían 1l de tampón de PCR 10x de Bioline, 0.3l de MgCl2 50mM de Bioline, 0.05l de cada uno de los dNTPs
100mM de Bioline, 0.5l de glicerol, 0.2l de cada uno de los cebadores a una concentración final de 0.75M y 0.12l de la enzima Taq Polimerasa de Bioline a una concentración de 0.06 U/l, en un termociclador Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9700 de Applied Biosystems.
El protocolo de amplificación constó de 3 minutos a 95ºC, de 10 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 45 segundos, de 25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 45 segundos y una extensión final de 10 minutos a 72ºC.
Se cargó un volumen de 5l a 7l de amplificado en el gel de agarosa (1.5%) tratado con bromuro de etidio, así como 4l de una solución diluida en agua ultrapura del marcador molecular DNA Molecular Weight Marker V 100 bp ladder de Roche (0.225 µg /µl) (1:15), con un rango de 8 pb a 587 pb, para la identificación de los alelos “inserción” y “no-inserción”, cuyo tamaño es de 484pb y 246pb respectivamente.
Durante el transcurso de esta investigación se sustituyó el bromuro de etidio por un colorante más seguro, GelRed de Biotium, que presenta una menor toxicidad, una susceptibilidad mayor y un espectro de emisión prácticamente idéntico, que permite mantener el mismo equipo de detección y captura de imagen. Ambos son colorantes que se intercalan entre las bases del ADN y que emiten fluorescencia cuando son iluminados por luz ultravioleta. Las muestras se dejaron migrar 20 minutos a 115 voltios. Finalizada la electroforesis se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta. Los
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resultados han sido documentados mediante un sistema de fotografía digital (Kodak Digital Science EDAS 120).
Microsatélites, PCR y electroforesis en capilar.
Se han analizado cuatro microsatélites- MAPT 07, MAPT 08, MAPT 09 y MAPT 14 - dentro de los límites de la inversión en todas las poblaciones del estudio. La longitud de los productos de la PCR fue determinada mediante el secuenciador ABI Prism 310 Genetic Analyzer y un marcador del tamaño molecular.
La región seleccionada fue amplificada mediante PCR empleando los siguientes cebadores (Donnelly et al, 2010), de los cuales uno de cada par estaba marcado por un fluorocromo:
Tabla M.3: Microsatélite, cebadores y modificación correspondiente.
Marcador Primer Modificación
STRP MAPT 07 F: 5´ TCA GAT TCG TTT CGG GGG TCG TTA TCG 3´ 5`FAM R: 3´ GCT GGA GGG TCT TCA CCA CCA GAT TCG C 5´
STR MAPT 08 F 5´ CAA TGA GCC AAG ATC ACA CCT ACT G 3´ 5`HEX R: 3´ GGG TCC TAT CAT TCT CTC TGC TAT CA 5´
STRPs MAPT 09 F 5´ TTC TTC TTG CCA ATA GCA AGG ATA C 3´ 5`FAM R: 3´ CAG TAT ATA CCC AGA AAA GTG CAA TGT G 5´
STRP MAPT 14 F 5´ CTC ACA AAT GTT CTC TGT CTC TTC TGT C 3´ 5`TET R: 3´ GAT GCA TCT AAT TTA AGG CAT CTT ATG A 5´
La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un volumen total de 10 l por muestra (concentración aproximada de ADN, 2 ƞg) con los siguientes volúmenes y concentraciones de reactivos de Bioline:
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Tabla M.4: Volúmenes y concentraciones de los reactivos empleados para la PCR.
Reactivo [concentración inicial] MAPT 07 Vol (l) MAPT 08 Vol (l) MAPT 09 Vol (l) MAPT 14 Vol (l) PCR Buffer [10x] 1 1 1 1 MgCl2 [50mM] 0.16 0.17 0.17 0.16 dNTPs [100mM] 0.02 0.15 0.1 0.15 Primer A [5M] 0.35 0.37 0.35 0.4 Primer B [5M] 0.35 0.37 0.35 0.4
H20up Hasta 10 l de volumen total
Taq Polimerasa [5 U/l] 0.1 0.1 0.08 0.1
ADN 0.1 – 0.2
La amplificación se realizó mediante el termociclador Gene Amp PCR System 9700 PE Applied Biosystems. Los programas empleados se detallan a continuación.
Tabla M.5: Programas empleados para la PCR.
MAPT 07 MAPT 08 MAPT 09 MAPT 14
1 95 30 seg 32 94 60 seg 7 94 60 seg 7 94 60 seg 7
2 45 20 seg 64,5 90 seg 62 90 seg 65 90 seg
3 72 30 seg 72 90 seg 72 90 seg 72 90 seg
1 95 60 seg 25 94 60 seg 25 94 60 seg 25
2 63 60 seg 60 60 seg 62 60 seg
3 72 60 seg 72 60 seg 72 60 seg
En todos los casos se llevó a cabo una desnaturalización previa de 10 minutos a 94ºC – salvo para el microsatélite MAPT07, para el cual la temperatura fue de 95ºC – y una extensión final de 10 minutos a 72ºC.
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Los números del 1 al 3 de la primera columna hacen referencia a los procesos de desnaturalización (1), anillamiento (2) y elongación (3). Dentro de las columnas de cada marcador se detallan, de izquierda a derecha, las temperaturas en ºC, los tiempos en segundos y el número de repeticiones del ciclo.
Todos los programas, menos el del marcador MAPT07, tienen dos grupos de ciclos, el primero a una temperatura de anillamiento superior al segundo, para prevenir la aparición de picos inespecíficos en el electroferograma.
El amplificado resultante de la PCR se mezcló con el fluorocromo Gene Scan 500 TAMRA (Applied Biosystems) como estándar interno y Hi-Di Formamida en proporción 1:1:18. El estándar permite detectar el tamaño y la cantidad de cada producto de PCR, ya que se usa como referencia para extrapolar el tamaño de los fragmentos amplificados, eliminando la variación entre capilares. Se ha empleado también como control positivo. La formamida se emplea para desnaturalizar las muestras de ADN antes de colocarlas en el analizador genético. La presencia de cantidades variables de agua y de iones no deseados en la formamida estándar puede causar problemas debido a la competencia de los citados iones con los iones del ADN o a la reacción de estos iones con el ADN, provocando la degradación de la muestra. Por ello se ha empleado formamida altamente desionizada.
Esta mezcla se sometió a una incubación a 95ºC durante 5 minutos para favorecer la desnaturalización del ADN e inmediatamente después se enfrió durante 3 minutos a -20ºC para detener la reacción (proceso también denominado estabilización).
La detección de fragmentos se realizó mediante el secuenciador automático de ADN ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) por electroforesis capilar a una diferencia de potencial de 15.0 kV y a una temperatura de 60ºC, tras un tiempo de inyección que ha variado entre cinco y diez segundos. Las muestras han migrado durante quince a treinta minutos en función del tamaño de los alelos de cada marcador.
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En cada análisis se incluyó como blanco una muestra de Gene Scan 500 TAMRA (Applied Biosystems) sin amplificado, además de una prueba de color para comprobar el adecuado funcionamiento del equipo, protocolo de uso recomendado por Applied Biosystems.
Se empleó el programa GeneMapper® ID Software v3.2.1 (Applied Biosystems) para la lectura de los resultados que con el marcador estándar Gene Scan 500 TAMRA como referencia realizó la asignación alélica para cada marcador estudiado.
Tabla M.6: En la primera columna se representa el nombre del alelo, que coincide con el número de repeticiones del mismo. En la segunda el símbolo.
MAPT 07 MAPT 08 MAPT 09 MAPT 14
15 201 bp 7 187 bp 13 107 bp 9 99 bp 16 203 bp 8 191 bp 14 109 bp 10 103 bp 17 205 bp 9 195 bp 15 111 bp 11 107 bp 18 207 bp 10 199 bp 16 113 bp 12 111 bp 19 209 bp 11 203 bp 17 115 bp 13 115 bp 20 211 bp 12 207 bp 18 117 bp 14 119 bp 21 213 bp 13 211 bp 19 119 bp 15 123 bp 22 215 bp 20 121 bp 16 127 bp 23 217 bp 21 123 bp 17 131 bp 24 219 bp 22 125 bp 18 135 bp 25 221 bp 23 127 bp 19 139 bp 26 223 bp 24 129 bp 20 143 bp 21 147 bp 22 151 bp 23 155