Case studies on the current use of the ICESCR in the context of disability

Referencias: Khachik y col. (1986); López-Hernández y col. (1993); Wright y col. (1997); Cartaxana y Brotas (2003).

Principio

Se basa en determinar la concentración de luteína,β-caroteno, clorofila a, clorofila b, feofitina a y feofitina b mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa y con detector diodo array.

Material y aparatos

 Balanza analítica, Adam Equipment modelo ADP 3100/L.  Balanza electrónica de precisión, Scaltec modelo SBA 31.

 Columna Sun Fire C18, Waters, con dimensiones de 250 mm × 4.6 mm, empacada

con partículas de 5 µm.

 Precolumna Sun Fire C18, Waters, con dimensiones de 20 mm × 4.6 mm,

empacada con partículas de 5 µm.

 Cromatógrafo líquido de alta resolución, que consta de: * Bomba para HPLC, Jasco modelo PU-1580.

1515.

* Horno de columna, Jetstream Plus serie 90305-2.

* Inyector manual, Rheodyne con bucle de inyección de 20 µL. * Sofware Borwin Chromatography, Jasco versión 1.50. * Sofware Borwin PDA, Jasco versión 1.50.

* Software HSS-2000 control Server, Jasco version 3.5.2.

* Unidad de gradiente ternario de baja presión (mezclador), Jasco modelo LG- 1580-02.

* Unidad LC-Net II/ADC, Jasco.

 Cubetas de cuarzo de 3.5 mL, Hëllma tipo 100.600-QG 10 mm.  Desgasificador, Gastorr modelo 154.

 Espectrofotómetro ultravioleta/visible de doble haz, Jasco modelo V-530 con Software Spectra Manager for Windows 95/NT, Jasco.

 Filtros de fibra de vidrio, Albet.

 Filtros de jeringa de nylon de 0.2 µm, Waters.  Jeringa de 50 µL, SGE.

 Material de vidrio de uso en laboratorio.  Rotavapor, Büchi modelo RE 111.  Vortex, Velp Scientifica.

Reactivos

 Agua Milli-Q, obtenida de un sistema purificador de agua Millipore Milli-Q plus.  Acetona, grado analítico, Scharlau Cód. AC0311.

 Acetonitrilo supragradient, grado HPLC, Scharlau Cód. AC0331.  Ácido clorhídrico fumante al 37 %, Merck Cód. 1.00317.1000.  Carbonato de calcio, Panreac Cód. 121212.

 β-caroteno, Sigma Cód. C-9750.  Clorofila a, Sigma Cód. C-5753.  Clorofila b, Sigma Cód. C-5878.

 2, 6-Di-ter-butil-4-metilfenol (BHT), Panreac Cód. 162825.1209.

 Diclorometano estabilizado con aproximadamente 50 ppm de amileno multisolvent, grado HPLC, Scharlau Cód. CL0347.

 Éter de petróleo 40-60 ºC, Panreac Cód. 141315.1612.  n-Hexano, grado HPLC, Merck Cód. 1.04391.2500.  Metanol, grado analítico, Scharlau Cód. ME0316.  Metanol grado HPLC, Merck Cód. 1.06018.2500.  Sulfato de sodio anhidro, Panreac Cód. 131716.

 Xantofila (luteína; α-caroteno-3-3´-diol), Sigma Cód. X-6250.  Solución de ácido clorhídrico, 0.1 N.

 Solución de cloruro de sodio al 10 %.

 Solución de éter de petróleo 40-60 ºC, con 0.1 % de BHT.  Solución de metanol, grado analítico, con 1 % de BHT.  Solución patrón de β-caroteno, se diluye en acetona.  Solución patrón de clorofila a, se diluye en acetona.  Solución patrón de clorofila b, se diluye en acetona.

 Solución patrón de feofitina a. Se prepara a partir de una solución patrón de clorofila a, a la cual se añaden 3 gotas de HCl 0.1 N, y se mantiene en la oscuridad durante 15 min.

 Solución patrón de feofitina b. Se prepara a partir de una solución patrón de clorofila b, a la cual se añaden 3 gotas de HCl 0.1 N, y se mantiene en la oscuridad durante 15 min.

 Solución patrón de luteína, se diluye en acetona. Condiciones de trabajo

 Fase móvil: mezcla inicial isocrática de acetonitrilo (75 %), metanol (15 %) y diclorometano/hexano (1:1) (10 %)

 Flujo de trabajo: 0.8 y 1.5 mL/min.  Modo: gradientea

Longitud de onda de detección: * Luteína: 450 nm * B-caroteno: 450 nm * Clorofila a: 430 nm * Clorofila b: 460nm * Feofitina a: 405 nm * Feofitina b: 432 nm

 Temperatura del horno: 25 ºC.

a

La fase móvil se compone de una mezcla isocrática de acetonitrilo (75 %), metanol (15 %) y diclorometano/hexano (1:1) (10 %) que se mantiene durante 9 min, seguida por un gradiente que termina a los 16 min con una composición final de acetonitrilo (40 %), metanol (15 %) y diclorometano/hexano (45 %), manteniéndose dicha proporción hasta los 24 min. Se usa un flujo constante de 0.8 mL/min. Al finalizar la separación, la columna es reequilibrada con la mezcla inicial isocrática, se aumenta el flujo a 1.5 mL/min en un gradiente que dura 1 min y se mantiene en esas condiciones hasta los 35 min, posteriormente el flujo cambia a 0.8 mL/min en un gradiente que termina a los 38 min y se mantiene con este flujo durante otros 2 min. La separación de los compuestos se logra en un tiempo de 22 min. La absorción visible de los mismos se mide a las longitudes de onda óptimas, seleccionadas en función de los máximos de absorbancia de los espectros registrados de cada componente.

Preparación de patrones

Se prepara una solución madre de pigmentos en 10 mL de acetona (López-Hernández y col. (1993). De aquí se toman las porciones necesarias para establecer una escala, de tal forma que las concentraciones de los pigmentos en la muestra queden en el rango de la escala establecida. La acetona se evapora bajo corriente de nitrógeno y se redisuelven las porciones en hexano, para luego ser inyectadas en el cromatógrafo.

Procedimiento

Los pigmentos se extrajeron tomando en cuenta las indicaciones dadas por Wright y col. (1997) y Cartaxana y Brotas (2003), pero con algunas modificaciones derivadas de la puesta a punto de este método. Todo el procedimiento se realiza con luz tenue.

Para la extracción de los pigmentos, se pesan 0.25 g de muestra liofilizada y finamente molida, se le agrega la misma cantidad de carbonato de calcio y se homogeniza completamente en un mortero. Dicha mezcla se transfiere a una probeta, se le añaden 10 mL de metanol (mantenido a 4 ºC y recien adicionado con 1 % de BHT) y se lleva a un baño de ultrasonidos con agua fría, durante 10 min. Posteriormente se filtra al vacío con filtro de fibra de vidrio. La extracción se repite una vez más. El filtrado se lleva a un matraz aforado de 50 mL y se enrasa con el metanol, antes mencionado.

Se toman 10 mL de la solución anterior y se llevan a un embudo de decantación, se le añaden 10 mL de éter de petróleo con 0.1 % de BHT, se agita cuidadosamente y enseguida, resbalando por las paredes del embudo, se agregan 10 mL de cloruro de sodio al 10 % (Khachik y col., 1986). Nuevamente se agita y se deja en reposo para que los pigmentos de la fase metanólica se transfieran a la fase etérea. Se desecha la capa inferior (metanólica) y se recupera la capa superior (etérea). A ésta se le agrega un 2 % de sulfato de sodio anhidro. La fase etérea, libre de agua, se evapora a temperatura ambiente en un rotavapor giratorio con corriente de nitrógeno. El extracto se disuelve en 2 mL de hexano y posteriormente se pasa a través de un filtro de nylon de 0.2 µm (Waters) y se inyecta en el HPLC.