Case Study: Accountable SDN Applications

Los ratones empleados en los modelos animales realizados fueron adquiridos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Los animales se mantuvieron bajo condiciones controladas de temperatura y humedad, con ciclos diarios de 12 h de luz y 12 h de oscuridad y con libre disponibilidad de alimento y agua. El cuidado y la manipulación de los ratones se realizaron de acuerdo a los lineamientos institucionales de buenas prácticas de trabajo con animales de laboratorio y con la aprobación del protocolo de experimentación por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (CICUAE) del Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia de la Universidad Nacional del Sur.

5.1. Modelo animal de xenotransplante subcutáneo con células de carcinoma celular escamoso de cabeza y cuello HN12

Para la obtención de este modelo se utilizaron 8 ratones N:NIH(S)-

Fox1nu (nude) machos sanos de 10 semanas de edad y de 25 g de peso

promedio. Los animales fueron inyectados en forma subcutánea con 5 × 106

células HN12 (Kawakami et al., 2004) en 100 µL de medio DMEM libre de

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animal, empleando jeringas de 1 mL con agujas hipodérmicas (BD) 0,80 x 25 mm (21G). A los 15 días, los ratones presentaban tumores con un diámetro aproximado de 4 mm por lo que fueron divididos aleatoriamente en dos grupos de 4 animales cada uno. Un grupo fue tratado con UVB1 en una dosis de 40 µg/kg de peso y el otro grupo con el vehículo de la droga, ambos compuestos

homogeneizados en 50 L de solución fisiológica. Cada ratón recibió 3

aplicaciones semanales (lunes, miércoles y viernes) administradas

subcutáneamente en la periferia del tumor. Antes de cada aplicación se midieron las dimensiones del tumor con un calibre digital para estimar su

volumen empleando la fórmula π/6 x A x B2 (se asume un forma elipsoidal;

Geran et al., 1972), siendo A y B las dos dimensiones del tumor. También se

registró el peso de cada ratón en estudio y su comportamiento. Luego de 12 dosis recibidas, los animales fueron anestesiados con Ketamina (50 mg/kg) /Acedan (1 mg/kg) aplicándose de manera intraperitoneal para realizar una extracción sanguínea del seno retro-orbital e inmediatamente sacrificados por dislocación cervical. El tumor obtenido por disección de cada animal fue pesado, fotografiado y medido en sus tres dimensiones: diámetro mayor (A), diámetro menor (B) y espesor (C), para calcular su volumen por empleo de la

fórmula: π/6 x A x B x C. El tumor, hígado, riñones y bazo fueron fijados en

formol al 10 % en PBS 1X por 24 h para su posterior análisis histológico.

5.2. Modelo animal de transplante singeneico con células de adenocarcinoma mamario LM3

Para la obtención de este modelo se utilizaron 15 ratones BALB/c hembras vírgenes sanas de 9 - 10 semanas de edad y de 20 g de peso

promedio. Cada ratón se inyectó en forma subcutánea con 4 × 105 células LM3

en 100 µL de medio DMEM libre de suero y antibiótico. El implante de las células se llevo a cabo en el dorso del animal empleando jeringas de 1 mL con agujas hipodérmicas 21G (BD). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medible con precisión (diámetro menor > 4 mm) los ratones fueron divididos en 2 grupos: experimental (n=7) y control (n=8). Los ratones del grupo experimental fueron tratados con 40 µg/kg de peso de UVB1 colocados en 50

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ratón recibió 3 aplicaciones semanales durante 2 semanas, administradas subcutáneamente en la periferia del tumor. Antes de cada aplicación se midieron las dimensiones del tumor con un calibre digital para estimar su

volumen empleando la fórmula π/6 x A x B2 (se asume un forma elipsoidal;

Geran et al., 1972), siendo A y B las dos dimensiones del tumor. También se

registró el peso de cada ratón en estudio y su comportamiento. Luego de dos semanas de tratamiento, los animales fueron anestesiados de la manera anteriormente descripta y sacrificados por dislocación cervical. El punto final del ensayo fue condicionado por el tamaño de los tumores y el estado general de los animales. El tumor obtenido por disección de cada animal fue pesado, fotografiado y medido en sus tres dimensiones: diámetro mayor (A), diámetro menor (B) y espesor (C), para calcular su volumen por empleo de la fórmula: π/6 x A x B x C. El tumor, hígado, riñones y bazo fueron fijados en formol al 10 % en PBS 1X por 24 h para su posterior análisis histológico. Los pulmones de los animales fueron fijados con solución de Bouin para determinar la presencia de metástasis.

5.2.1. Procesamiento de pulmones para cuantificación de metástasis

Al momento de la disección, los pulmones obtenidos de cada ratón

fueron fijados en Bouin durante 24 h (Tabla 9) (Kim et al., 2011). Luego, se

determinó el número de metástasis en la superficie de los lóbulos pulmonares de cada ratón utilizando una lupa Nikon SMZ1500 con cámara digital acoplada (Nikon ACT-1 Versión 2.63) para la adquisición fotográfica.

Tabla 9. Composición de la mezcla fijadora Bouin

Reactivos Cantidad empleada

Solución acuosa sobresaturada de ácido

pícrico 2 g / 100 mL 700 mL

Formol 40 % 250 mL

Ácido acético glacial

María Julia Ferronato Página 89 5.3. Modelo animal de xenotransplante subcutáneo con células de carcinoma colorrectal HCT116

Para la obtención de este modelo se utilizaron 12 ratones N:NIH(S)-

Fox1nu (nude) machos, sanos, de 10 semanas de edad y de 25 g de peso

promedio. Los animales fueron inyectados en forma subcutánea con 5 × 106

células HCT116 (Kim et al., 2014) de la misma forma descripta en los modelos

anteriores. A los 10 días, los ratones presentaban tumores con un diámetro aproximado de 5 mm, por lo que fueron divididos aleatoriamente en 2 grupos de 6 ratones cada uno. Un grupo fue tratado con UVB1 en una dosis de 40 µg/kg de peso y el otro grupo (control) con el vehículo de la droga, ambos

compuestos homogeneizados en 50 L de solución fisiológica. Cada ratón

recibió 3 aplicaciones semanales (lunes, miércoles y viernes) durante 4 semanas, administradas de manera subcutánea en la periferia del tumor. Antes de cada administración de droga se midieron y estimaron las dimensiones del tumor del mismo modo descripto anteriormente. Luego de 12 dosis recibidas, se les extrajo sangre y a continuación los animales fueron sacrificados por dislocación cervical. El tumor obtenido por disección de cada animal fue pesado, fotografiado y medido tal como se describió en los modelos animales anteriores. Los órganos de los ratones, hígado, riñones y bazo, fueron recolectados para su posterior análisis histológico.