La marcación de una muestra con FDA/IP y su evaluación por citometría de flujo, es una técnica que permite analizar la viabilidad celular a nivel individual en un gran número de células por tratamiento. Además, para clasificar un determinado evento como viable o no viable mediante este método, se tienen en cuenta dos variables: la actividad metabólica y la permeabilidad de membrana de cada célula en particular. Al realizar los experimentos, las células vivas mostraron alta fluorescencia para FDA y fueron negativas para IP. Por el contrario, las células muertas mostraron alta fluorescencia para IP debido a la perdida de permeabilidad de membrana, mientras que exhibieron baja o nula fluorescencia para FDA, debido a la ausencia de actividad metabólica (Fig. 3.1). Al exponer las células a los tratamientos, se observó que aquellas que aun eran negativas para IP mostraban una disminución continua de la intensidad de fluorescencia para FDA mientras que el pasaje de IP negativo a IP positivo se da de manera abrupta. Este tipo de análisis provee una idea del camino que recorren las células al pasar de vivas a muertas luego de ser expuestas a agentes citotóxicos (Fig. 3.1C, flecha). Esta transición continua de vivas a muertas también pudo observarse en los gráficos de dispersión de fluorescencia (FSC vs. SSC), en donde las células al perder la viabilidad pasan de mostrar un alto FSC y bajo SSC (mayor tamaño y menor complejidad celular) a bajo FSC y alto SSC (Fig. 3.1B, flecha). Las células que se encuentran atravesando el programa de muerte se observan como IP negativas (permeabilidad de membrana intacta) pero con baja fluorescencia para FDA (baja actividad metabólica) y se ubican en un punto intermedio de este camino de muerte (Fig. 3.1C y 1D). Si interpretamos los diagramas de FDA vs IP como un gráfico de probabilidades según el número de eventos presentes en cada sector, veremos que la probabilidad de encontrar un evento en cada cuadrante del gráfico, depende de la magnitud del efecto citotóxico generado por un tratamiento a una dosis dada. Es decir, cuanto mayor es el efecto citotóxico ejercido por el tratamiento, mayor será la probabilidad de hallar células FDA negativas/IP positivas (Fig. 3.1, cuadrantes Q1) y menor la de encontrar FDA positivas/IP negativas (Fig. 3.1, cuadrantes Q4).
Resultados _____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________ 35 Figura 3.1. Determinación de viabilidad por citometría de flujo mediante marcación con FDA- IP. (A) Células U937 sin tratamiento con predominancia de células vivas, que muestran alta fluorescencia para FDA (verde) y nula para IP (rojo), indicando alta actividad metabólica e integridad de membrana conservada. (B) La población que aparece en verde muestra las propiedades de dispersión de luz frontal (FSC) y lateral (SSC) de las células mostradas en A. (C) Células U937 tratadas por 72hs con TOA 5µM, se observa una disminución en el porcentaje de células FDA positivas (vivas). Las células muertas se observan como FDA negativas y con alta fluorescencia para IP (rojo). Se observa además que parte de la población FDA positiva sufre una disminución en la intensidad de fluorescencia. La flecha muestra el camino que siguen los cambios en la fluorescencia al pasar las células de vivas a muertas (camino de muerte). (D) El área verde muestra las propiedades de dispersión de luz exclusivas de la células vivas, el área roja las de las células muertas, mientras que el área amarilla muestra las propiedades de dispersión compartidas por ambos estados. Unos pocos puntos azules evidencian que solo una minoría de las células presenta ambas marcas. La flecha muestra los cambios en los patrones de dispersión de luz al pasar de vivas a muertas.
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(E) Muestra tratada con TOA 10M por 72hs en donde se observa predominio de células IP positivas (muertas). (F) Propiedades de dispersión de luz de la muestra que se observa en E.
3.1.2 Efecto citotóxico de las drogas individuales sobre las líneas celulares
A partir de la distribución de eventos en cada cuadrante de los gráficos de FDA vs IP, nos fue posible calcular el porcentaje de muerte inducido por los tratamientos en un amplio rango de dosis. Luego, mediante regresión logística de los datos obtenidos experimentalmente, se obtuvieron las dosis de efecto citotóxico medio (Dm) de TOA, MG132 y CAPE a 72hs de tratamiento en las células U937 y Raji, utilizando un modelo cuantal de dosis respuesta (Casarett
et al., 2008; Tallarida, 2001). Posteriormente, se construyeron las curvas de predicción de efecto en todo el rango de efecto citotóxico (Figs. 3.2 y 3.3). A partir de este punto nos referiremos al valor medio (Dm) obtenido como concentración efectiva 50 (CE50). La CE50 de TOA en la línea U937 que se calculó a partir del grafico de efecto medio fue de 7.37M (Fig. 3.2A, D). La CE80 calculada a partir de la curva dosis respuesta fue superior a 18M. En Raji se obtuvo una CE50 de 10.0M mientras que la CE80 calculada fue superior a 30M (Fig. 3.3A, D). Las altas dosis necesarias para ejercer citotoxicidad sobre las líneas U937 y Raji fueron concordantes con su ya descripta característica de resistencia al arsénico (Jing et al., 1999). La CE50 de MG132 fue de 2.1µM en U937 con una CE80 calculada inferior a 4µM (Fig. 3.2B, E). En Raji la CE50 fue 0.7µM con una CE80 por debajo de 1.2µM (Fig. 3.3B, E). La CE50 de CAPE en U937 fue de 247µM con una CE80 superior a 275µM (Fig. 3.2C, F). En la línea celular Raji, la CE50 de CAPE fue de 197µM, mientras que la CE80 obtenida fue mayor a 236µM (Fig. 3.3C, F). Los resultados obtenidos para los tratamientos individuales en ambas líneas se encuentran resumidos en la Tabla 3.1.
Resultados _____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________ 37 Figura 3.2. Cálculo del efecto citotóxico medio y curvas de predicción de efecto para las drogas individuales en la línea U937. Se muestran los resultados experimentales por triplicado (círculos abiertos) y la recta de regresión correspondiente a la ecuación de efecto medio, junto a los parámetros obtenidos para calcular la dosis media (Dm) de efecto citotóxico para las tres drogas individuales en la línea U937 (A, B y C). A partir de estos datos se calcularon las curvas de predicción de efecto (línea llena) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% (líneas punteadas) (D, E y F). m= pendiente de la recta de regresión, y-int= valor de intersección del eje y correspondiente al valor log(D)=0, r= coeficiente de correlación.
_____________________________________________________________________________ 38 Figura 3.3. Cálculo del efecto citotóxico medio y curvas de predicción de efecto para las drogas individuales en la línea Raji. Se muestran los resultados experimentales por triplicado (círculos abiertos) y la recta de regresión correspondiente a la ecuación de efecto medio, junto a los parámetros obtenidos para calcular la dosis media (Dm) de efecto citotóxico para las tres drogas individuales en la línea Raji (A, B y C). A partir de estos datos se calcularon las curvas de predicción de efecto (línea llena) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% (líneas punteadas) (D, E y F). m= pendiente de la recta de regresión, y-int= valor de intersección del eje y correspondiente al valor log(D)=0, r= coeficiente de correlación.
Resultados _____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________ 39 Tabla 3.1. CE de efecto citotóxico a 72hs calculadas para los tres tratamientos individuales. Se muestra un resumen de las CE a 72hs calculadas a partir de las curvas de predicción de efecto obtenidad para TOA, MG132 y CAPE en todo el rango de efecto citotóxico.
Resulta interesante resaltar que al comparar la respuesta de ambas líneas celulares frente a las drogas individuales, en cuanto a la dosis necesaria para alcanzar un efecto citotóxico dado, se observó que MG132 es el tratamiento que exhibe mayor potencia relativa en ambos casos, seguido de TOA y finalmente por CAPE. Por otro lado, al analizar la respuesta de ambas líneas frente a un tratamiento dado, se observa que con respecto al TOA, la línea U937 presenta mayor sensibilidad (CE50=7,37µM) que la línea Raji (10.0µM). Por el contrario U937 presentó mayor resistencia a MG132 y CAPE (2.1µM y 247µM respectivamente) en comparación con Raji (0.7µM y 197µM).
Nivel de Efecto (CE%)
a 72h TOA(M) SD MG132(M) SD CAPE(M) SD Línea U937 EC25 3.93 0.37 1.35 0.08 218 4 EC30 4.53 0.38 1.50 0.09 223 4 EC40 5.84 0.43 1.80 0.11 231 4 EC50 7.37 0.52 2.13 0.14 239 4 EC70 11.99 1.06 3.02 0.23 255 5 EC80 16.33 1.80 3.78 0.32 265 6 EC90 26.00 3.93 5.29 0.55 282 8 Línea Raji EC25 6.53 0.28 0.35 0.04 172 9 EC30 7.19 0.29 0.50 0.05 177 8 EC40 8.50 0.29 0.91 0.08 187 8 EC50 9.93 0.30 1.58 0.13 197 8 EC70 13.71 0.35 3.52 0.60 220 8 EC80 16.84 0.44 5.92 1.19 236 9 EC90 22.95 0.75 12.93 3.30 261 12
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