La complejidad del resultado de la interacción del TOA con otras drogas en cuanto a su efecto citotóxico, hace necesario el uso de métodos como el del índice de combinación de Chou-Talalay. Este método permite analizar el efecto de múltiples drogas combinadas, obteniendo un indicador que establece si existe sinergismo, aditividad o antagonismo, para cada nivel de efecto citotóxico
(Chou, 2010; Chou et al., 1984; Peng et al., 2010). El análisis parte de la evaluación de la función dosis vs efecto citotóxico de los fármacos individuales. Luego se evalúa la función dosis vs efecto citotóxico usando una combinación de los fármacos en estudio. Esto permite tener una primera aproximación sobre la potencia citotóxica de ambas drogas en forma individual y aquella que resulta al combinarlas. La medida más importante de la potencia citotóxica, es la dosis citotóxica que produce la muerte en el 50% de las células (CE50). Para obtenerla se utiliza un procedimiento de regresión sobre datos experimentales, en el que se deben utilizar concentraciones crecientes en el
Introducción ________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________ 17 rango que producen efectos citotóxicos crecientes, hasta alcanzar valores cercanos al 100%. Este procedimiento se conoce como análisis o método de efecto medio. De manera ideal la función dosis vs efecto citotóxico debe construirse en base a la identificación de muerte en células individuales. Esto permite el uso de modelos probabilísticos (modelos cuánticos) en los que nada se asume acerca de los principios fisicoquímicos de la interacción droga-receptor (modelos determinísticos). Simplemente se debe evaluar la ocurrencia o no de muerte en cada célula analizada. En la combinación de dos fármacos citotóxicos a y b, uno tendrá menor potencia que otro, por lo cual, por ejemplo, CE50a será menor que CE50b, si a es el fármaco más potente. Al combinarlos la potencia de a+b será intermedia entre CE50a y CE50b. Si la potencia CE50a+b es exactamente intermedia, se dice que el efecto es aditivo y esto Indica que el fármaco b es como una forma diluida del fármaco a en cuanto al efecto citotóxico. Si la potencia citotóxica de la combinación decrece y la CE50a+b se acerca a la potencia CE50b, se dice que la interacción es antagónica. En ese caso podemos suponer que se ha afectado el mecanismo inductor de muerte celular de los fármacos combinados, y/o las células han logrado mejorar su respuesta de supervivencia, frente a la noxa que representa el tratamiento citotóxico. En cambio, cuando la potencia de la combinación aumenta, y CE50a+b se acerca a la CE50a, se dice que ocurre sinergismo. Significa en este caso que ha mejorado la efectividad de los mecanismos citotóxicos de los fármacos combinados, y/o se han deteriorado las respuestas protectoras de las células. El índice de combinación hace una comparación de la potencia citotóxica de cada fármaco, cuando se aplica en forma individual y cuando se aplica combinado. Establece así una relación entre la potencia de cada fármaco cuando actúa sólo y la potencia cuando se encuentra combinado. Cuando el CI > 1 indica que la potencia relativa en la combinación decrece, mientras que cuando el CI <1 indica que la potencia relativa citotóxica aumenta. Por último, cuando el CI=1, nos indica que la potencia de los fármacos cuando están combinados, es similar en términos relativos, a la potencia que tienen cuando se los usa de manera individual. Lo interesante del CI es que nos brinda esta información no solamente para el nivel de efecto 50%, sino para todo el rango de efectos. De esta manera brinda una importante información acerca del comportamiento biológico de las células, frente a las combinaciones de los fármacos citotóxicos. En el Anexo I se hace una descripción detallada del método y se da un fundamento para su aplicación e interpretación.
Así como el conocimiento de los mecanismos puede sugerir el tipo de interacción farmacológica más probable, el análisis de interacciones puede de manera recíproca orientar el estudio de los
________________________________________________________________________________ 18 mecanismos moleculares que determinan la sensibilidad y la resistencia a un determinado tratamiento (Cavaliere et al., 2014; Lombardo et al., 2012a; Lombardo et al., 2012b).
1.6.2 ¿Cómo medir la influencia de las respuestas de stress en la muerte
regulada? La CE50 como indicador del punto de equilibrio “Noxa vs
respuesta celular de stress”
Claramente la intensidad de la noxa y la intensidad de las respuesta celulares de stress tienen un punto de equilibrio. En términos de fármacos citotóxicos, este punto de equilibrio se corresponde con la dosis citotóxica 50% (CE50). Es decir, la dosis en la cual los mecanismos de sobrevida dominan en el 50% de las células, y los mecanismos iniciadores de la muerte celular dominan en el 50% restante (Chou, 2010). Esto ilustra que cuanto mayor sea la dosis CE50 del fármaco citotóxico, mayor es la intensidad de las respuestas celulares de stress, capaces de oponerse al inicio de la muerte regulada (Fig. 1.3B). Esto es particularmente útil en estudios con fármacos que tienen como blanco respuestas de stress específicas, como el sistema ubiquitina-proteasoma, la mitofagia y la autofagia. En particular cuando se los combina con fármacos iniciadores de muerte celular, como por ejemplo los inductores de la llamada apoptosis intrínseca o mitocondrial. De esta forma es posible medir la competencia entre los mecanismos iniciadores de muerte celular y las respuestas de stress que se oponen (Fig. 1.3B). Es decir, aplicando un viejo dogma de la Toxicología a la muerte celular regulada, podemos afirmar que: “todo fármaco es citotóxico; sólo depende de la dosis”. La CE50 es la mínima dosis capaz de iniciar la muerte regulada venciendo a las respuestas de stress en el 50% de las células
(Fig. 1.3B).