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BIPOLARESYHORIZONTALESENLASRATASP23H.

Dado el estado de degeneración de conos y bastones, quisimos comprobar si los fotorreceptores supervivientes preservaban la conectividad sináptica en la OPL. Con este fin utilizamos un anticuerpo contra Bassoon, utilizado en anteriores investigaciones de nuestro grupo (Cuenca, Pinilla et al. 2004). En la retina de los vertebrados se ha encontrado una intensa inmunorreactividad a Bassoon en ambas capas plexiformes (Brandstatter, Fletcher et al. 1999). En la OPL el Bassoon se localiza en las sinapsis “en cinta”, formadas por conos o bastones y las neuronas secundarias (Cuenca, Pinilla et al. 2004). En las ratas P23H se apreció una menor densidad de contactos sinápticos marcados con Bassoon, en comparación a lo observado en ratas SD (Figura 31.). En las ratas P23H, la distribución de las sinapsis marcadas es irregular y desorganizada, incluso se apreciaron zonas de la retina, sobre todo periféricas, que carecían de sinapsis.

Figura 31. Sinapsis de los fotorreceptores con sus neuronas secundarias en de ratas SD y P23H

Se muestra el marcaje para Bassoon en cortes de retina de una rata SD (A) y P23H (B). Los núcleos están marcados con TO-PRO-3. Se aprecia la mayor cantidad de cintillas sinápticas positivas para Bassoon (flechas) en la rata SD. Barra de escala, 10 µm.

Con el fin de comprobar el estado de las terminaciones axónicas de los fotorreceptores de las ratas P23H y el de sus contactos con células postsinápticas, llevamos a cabo un marcaje para sinaptofisina y GNB3. La sinaptofisina (SYP) es un marcador de las vesículas presinápticas presentes en los pedículos de conos y esférulas de bastones (Fernandez-Sanchez, Lax et al.

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2011). El GNB3 (Guanine nucleotide-binding protein 3) es un marcador de las células bipolares ON (Fernandez-Bueno, Fernandez-Sanchez et al. 2012). A P90, las ratas P23H tratadas con vehículo muestran puntos aislados de inmunotinción para SYP, en comparación con lo observado en ratas SD, donde el marcaje es mucho más denso (Figura 32, flechas). La capa OPL de los animales P23H mostró un aspecto plexiforme discontinuo. La pérdida de vesículas sinápticas indica una pérdida de funcionalidad de los axones de los fotorreceptores. En los conos remanentes de la retina periférica, encontramos marcaje deslocalizado de SYP a lo largo de toda la célula fotorreceptora, desde el axón hasta el segmento externo, este tipo de marcaje indica la desestructuración de la zona axonica del fotorreceptor (Figura 32, puntas de flecha).

Figura 32. Terminales presinápticas de los fotorreceptores de ratas SD y P23H

Se muestran las secciones verticales de retina central (A, B) y periférica (C, D) a P90 de ratas SD (A, C) y de ratas P23H (B, D). El marcaje para GNB3 muestra células bipolares ON (rojo), mientras el marcaje para SYP muestra las vesículas presinápticas de conos y bastones (verde, flechas). Los núcleos están marcados con Hoescth (azul). Se aprecia cómo los contactos sinápticos entre fotorreceptores y células bipolares están mucho más deteriorados en las ratas P23H. En las ratas P23H encontramos también marcaje deslocalizado de SYP en los somas celulares de los conos (puntas de flecha). Barra de escala, 20 µm.

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Con el fin de cuantificar los efectos de la mutación P23H sobre los las terminales axónicas de los fotoreceptores, medimos el área marcada con SYP (superficie inmunopositiva SYP /mm de sección retinal) en la OPL de ratas P23H y SD, y encontramos que el área fue significativamente más pequeña en las ratas P23H, en comparación con las ratas SD (test t de Student, p < 0.001) (Figura 33).

Figura 33. Área relativa de inmunomarcaje para SYP en la OPL de ratas SD y P23H

Se muestra el área relativa en los terminales axonicos de la OPL, expresado como superficie inmunopositiva/mm de sección retinal de ratas SD (negro) y P23H (gris). ***Test t de Student, p < 0.001. Dado el estado de degeneración de los fotorreceptores y sus terminales axónicas en las ratas P23H, analizamos la estructura y densidad de células bipolares de la retina de estos animales, en comparación con lo observado en ratas SD. Las células bipolares de bastón se marcan con anticuerpos contra la isoforma α de proteína kinasa C (PKC-α) (Cuenca, Pinilla et al. 2004). Estas células se caracterizan por establecer conexiones con las esférulas de bastones en la OPL a través de un largo amplio árbol dendrítico. Sus axones corren hasta la IPL, donde acaban en una terminal axónica bulbosa en el estrato S5 (Figura 34).

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Figura 34. Terminaciones sinápticas de células bipolares tipo ON de ratas SD y P23H

Las secciones verticales de retina central (A, B) y periférica (C, D) con inmunolocalización para PKC-α evidencian las células bipolares tipo ON en SD a P120 (A, C) y P23H (B, D) En alto a la derecha de cada imagen una magnificación del árbol dendrítico de una célula bipolar en el OPL. Los núcleos están marcados en azul con TO-PRO-3. Se aprecia el cuerpo celular y las dendritas en mejor estado en las ratas SD (puntas de flecha), tanto en zonas centrales como periféricas de la retina. Barra de escala, 20 µm y 10 µm en las magnificaciones.

En las ratas P23H, las células bipolares de bastón muestran menos cuerpos celulares y una retracción de sus dendritas. Las ramas dendríticas eran escasas y algunas células prácticamente no presentan dendritas. Los cuerpos celulares no estaban alineados, y las terminales axónicas mostraban baja inmunoreactividad. Las células bipolares de las ratas SD mostraron una compleja arborización, con dendritas uniformemente repartidas por la OPL.

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Los somas celulares de ratas SD estaban mejor alineados, con terminales axónicas más grandes, con varicosidades terminales laterales propias de estas células (Figura 34).

La intensidad de la inmunoreactividad observada en las ratas P23H resultó significativamente menor que la medida en las ratas SD (test t de Student, p < 0.01) (Figura 35). Estos resultados histológicos concuerdan con las diferencias en la amplitud de la onda b encontradas entre ratas P23H y ratas SD.

Figura 35. Inmunoreactividad relativa a PKC-α en la retina de ratas SD y P23H

Se muestra la inmunoreactividad relativa a PKC-α de las células bipolares de bastones en la retina central de ratas SD (negro) y P23H (gris). **Test t de Student, p < 0.01.

Dada la pérdida de integridad de las células bipolares ON de bastón en ratas P23H, también analizamos la estructura de las células horizontales y su conectividad con los fotorreceptores de ratas P23H y SD. Los somas de las células horizontales se localizan en la INL, y establecen conexiones con conos y bastones. Las células horizontales de la retina de rata pueden ser identificadas usando anticuerpos contra calbindina (Peichl, Gonzalez-Soriano 1994). A diferencia de otros mamíferos, en la retina de rata se ha descrito un subtipo (denominado B) de célula horizontal, cuyas dendritas establecen contactos sinápticos con los pedículos de los conos y cuyas terminales axónicas contactan con las esférulas de los bastones (Kolb 1991,

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Kolb H. et al. 2013). En las ratas SD, la inmunotinción punteada para calbindina marca el árbol dendrítico de las horizontales, el cual típicamente protruye desde el cuerpo celular (Figura 36, flechas). En las imágenes de retinas de ratas SD bien conservadas se puede distinguir el árbol dendrítico que llega a conectar con los axones de los conos. Además se muestra la elongación axonica tangencial hacía la OPL que acaba conectando con los bastones. De esta manera las células horizontales forman un puente sináptico indirecto entre conos y bastones, el cual permite interacciones relacionadas con el contraste de colores (Kolb H. et al. 2013).

A P90 las ratas del grupo P23H tratadas con vehículo muestran pérdida y/o retracción de las terminales sinápticas de las células horizontales, concomitante con el descenso en el número de filas de fotorreceptores (Figura 36).

Figura 36. Inmunolocalización para calbindina y Bassoon en la retina de rats SD y P23H.

Se muestran secciones verticales de retina de rata SD (A, C, E) y P23H (B, D, F), con las células horizontales marcadas con anticuerpo para calbindina, y las cintillas sinápticas de los fotorreceptores marcadas con Bassoon. Los núcleos están marcados con TO-PRO-3. Se aprecia un mayor número de contactos sinápticos (flechas) entre células horizontales y fotorreceptores en las ratas SD. Todas las imagines son tomadas de retina central, cerca del nervio óptico. Barra de escala, 10 µm.

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Con el fin de averiguar si la degeneración en la arborización de las células horizontales se correlacionaba con la degeneración de la conectividad sináptica en la OPL, realizamos un doble marcaje para calbindina y Bassoon. En las ratas SD se pudieron observar las típicas manchas de Bassoon con forma de herradura, que corresponden a las esférulas de bastones, asociadas a las terminales dendríticas de las células horizontales marcadas para calbindina. En las ratas P23H, las imágenes obtenidas ponen en evidencia el menor número de sinapsis entre fotorreceptores y células horizontales, en comparación lo observado en ratas SD (Figura 36). Esta observación indica que a la perdida de fotorreceptores sigue la pérdida de células horizontales, de sus dendritas y de las conexiones sinápticas entre estos dos tipos celulares.

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