Se analizaron por triplicado los ingredientes y los alimentos experimentales fabricados en la planta de alimentos del CIBNOR. El análisis químico proximal desarrollado fue de acuerdo a la metodología recomendada por la AOAC (2005). La humedad se determinó por secado en estufa a 70 °C durante 24 h. La cuantificación de cenizas (C) o minerales (método 942.05), se desarrolló por incineración de las muestras en una mufla (Thermolyne modelo F6000, Dubuque, IA, EUA) a 550 °C durante 6 h.
El análisis de proteína cruda (PC) (método 2001.11), se realizó de manera indirecta cuantificando la concentración de nitrógeno en las muestras en un digestor (Kjeltec modelo 2040, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) y destilador automático (Kjeltec modelo 2300, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) con la técnica micro Kjeldahl (N x 6.25). La cuantificación de extracto etéreo (EE) (método 2003.05), se hizo usando un sistema de auto extracción (Soxtec Avanti modelo 2050, Foss Tecator, Höganäs, Suiza), usando como solvente extractor éter de petróleo. Para determinar la fibra cruda (FC) (método 978.10), se usó una hidrólisis ácido-básica con ácido sulfúrico e hidróxido de sodio en un digestor (Fibertec modelo M6, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) equipado con una unidad de extracción caliente (modelo 1020, Foss Tecator, Höganäs, Suiza) y una unidad de extracción fría (modelo 1021, Foss Tecator, Höganäs, Suiza).
Se calculó el extracto libre de nitrógeno (ELN), a partir de la diferencia entre 100% y la suma de las determinaciones anteriores. La concentración de proteína se determinó en las
excretas colectadas en el bioensayo de digestibilidad usando la metodología (2001.11) descrita anteriormente (AOAC, 2005).
I.2.2. Energía bruta
Para la determinación de energía de combustión o energía bruta se usó un calorímetro adiabático (Parr Instrument Co., Modelo 1261, Moline, IL, EUA). Para ello, se utilizaron crisoles de acero inoxidable, donde se colocaron pastillas de 1g de las muestras, secadas previamente a 70°C en una estufa por 12 h: se empleó alambre (10 cm) con una aleación de niquel-cobre el cual estaba en contacto con la muestra. La muestra fue incinerada en una cámara de combustión alimentada con oxígeno. Posteriormente, los residuos líquidos de la combustión fueron recuperados y titulados con carbonato de sodio 0.725 N; el naranja de metilo fue empleado como indicador y también se cuantificó la cantidad de alambre calcinado durante la combustión para los cálculos de la energía liberada.
I.2.3. Determinación del perfil de aminoácidos
Para cuantificar el contenido de aminoácidos en los ingredientes (n = 17), alimentos (n = 18) y heces (n = 54) de los camarones, se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Agilent 1100 (Santa Clara, CA, EUA). El análisis de los aminoácidos requiere la preparación previa de las muestras por medio de un proceso de hidrólisis, durante este proceso se rompen las uniones en las proteínas y los péptidos mediante un compuesto ácido según el método 994.12 descrito por la AOAC (2005). Sin embargo, el compuesto ácido degrada a los aminoácidos azufrados (metionina y cistina) y su
cuantificación sería subestimada (Wathelet, 1999), por lo que, las muestras que fueron utilizadas para cuantificar a la metionina y a la cistina fueron protegidas, previamente a la hidrólisis ácida, por medio de su oxidación con ácido perfórmico, para ser cuantificados finalmente como metionina sulfona y ácido cisteíco, respectivamente (Bonn et al., 1991).
I.2.3.1. Hidrólisis ácida
Para iniciar este procedimiento se emplearon: 10 mg del material a analizar, seco y delipidizado, para muestras con más de 40% de proteína cruda, y 15 mg del material seco delipidizado para muestras con menos de 40% de proteína cruda. Todas las muestras se delipidizaron en el laboratorio de Bromatología usando un equipo Soxtec Avanti (según fue descrito en la sección de análisis químico proximal).
Para la hidrólisis ácida, se adicionaron 3 mL de HCl 6N/fenol a los viales ámbar de 10mL, agitándose por 15 minutos trabajando siempre en la campana de extracción. Se engargolaron los viales con sellos metálicos y se colocaron en una estufa previamente calentada a 110 °C para su hidrólisis por 24 h.
I.2.3.2. Oxidación de las muestras con ácido perfórmico
El proceso de oxidación es requerido para la determinación de los aminoácidos azufrados metionina y cistina. Una vez oxidados, fueron cuantificados como metionina sulfona y ácido cisteico (Bonn et al., 1991; Baker, 1997).
El ácido perfórmico fue preparado según la cantidad de muestras a oxidar en múltiplos de 25 mL; por cada 25 mL de la solución se usaron 0.125g de fenol, 2.5 mL de agua oxigenada y 22.5 mL de ácido fórmico. Estos reactivos fueron mezclados en un vaso de 100 mL y se mantuvieron en agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se mantuvo en reposo en el refrigerador (4°C), durante 20 minutos antes de su uso. El reactivo debe estar recién preparado para su uso en la oxidación de la metionina y la cistina.
Las muestras ya pesadas, se mantuvieron en refrigeración (4°C). Se adicionó 1 mL del ácido perfórmico a cada muestra contenida en viales ámbar de 10 mL, los cuales se taparon con la septa y se agitaron por 15 minutos a temperatura ambiente (25°C). El gas generado al quitar la septa fue eliminado con precaución. Se colocaron nuevamente las septas y se sellaron con papel parafilm, trabajando siempre en la campana de extracción.
Finalmente, las muestras se agitaron por 16 horas en un refrigerador (4°C). Después de ese tiempo los viales se elevaron a temperatura ambiente y se retiró el papel parafilm. Se agregaron 0.168 g de meta-bisulfito de sodio a cada uno de los viales, y se agitaron por 45 minutos a temperatura ambiente. A partir de este paso se adiciona el HCl (3 mL, 6N) y se repite el procedimiento que fue descrito anteriormente para la hidrólisis ácida.
I.2.3.3. Preparación de fases móviles Fase A (1000 mL)
Se pesaron 1.64 g de acetato de sodio anhidro y se transfirieron a un vaso de precipitado de 1 L; se agregó un 1 L de agua desionizada y se agitó hasta que se disolvió completamente, adicionando al final 180 µl de trietilamina (TEA) y se mezcló. Se ajustó el pH a 7.2 ± 0.05, adicionando acido acético al 2%. Por último, se agregaron 3 mL de tetrahidrofurano (THF), y se mezcló. La fase terminada se filtró en una membrana de nylon de 45 μm.
Fase B (1000 mL)
Se pesaron 1.64 g de acetato de sodio anhidro que fueron transferidos a un vaso de precipitado de 1 L, agregando 200 mL de agua desionizada y ajustando el pH a 7.2 ± 0.05, adicionando ácido acético al 2%. Al final se agregaron 400 mL de acetonitrilo y 400 mL de metanol, se mezcló, y se filtró la fase usando una membrana de nylon de 45 μm.
I.2.3.4. Derivatización
La derivatización se desarrolló en un sistema de dos fases: Fase A (acetato de sodio 0.003 M, pH 7.2, tetrahidrofurano) y Fase B (acetato de sodio/acetonitrilo 1:4, 0.1 M, pH 7.2). Los derivatizantes usados fueron OPA (σ-optal-aldehído y ácido 3-mercapto-propiónico (Agilent Technologies, No. 5061-3335) y FMOC (9-fluorenil-metilcloro-formato (Agilent Technologies, No. 5061-3337).
Se usó una columna hipersil ODS 5 µm (200 × 2.1 mm, Agilent) para los nueve aminoácidos esenciales analizados, protegida con una pre-columna hipersil ODS Agilent (20 × 2.1 mm), y una columna microsorb (100-3 C18, 100 × 4.6 mm, Varian, Lake Forest, CA) para el análisis de cistina.
El análisis de aminoácidos (Wu et al., 1997) fue realizado en un equipo de cromatografía de alta resolución HPLC fase-reversa (Model 1100, Hewlett Packard, Santa Clara, CA). Para la determinación se inyectó 1.0 µl de la muestra a un flujo de 0.45 mL/min a una temperatura de columna de 40 ºC. El gradiente del derivatizante se inició con 100% fase A, a los 17 min del inicio 60% de fase B, continuando con 100% de fase A (a 18 min del inicio); a los 18.1 min el flujo fue de 0.45 mL/min, de los 18.5 min a los 23.9 min el flujo fue de 0.8 mL/min, continuando a los 24 min con 100% de la fase B a un flujo de 0.45 mL/min, y concluyendo a los 25 min con 0% de la fase B.