CHAPTER 5. SIMULATION OF THE MODEL
5.1 Chaos Expansions Applied to the Model
Marcellino, R.; Robles, C. Grupo de Salud Animal INTA Bariloche
Introducción
La afección llamada “lana sisal” o “lana engrasada” presenta una amplia distribución en ovinos Merino de la Patagonia Argentina. El vellón de los animales afectados se caracteriza por presentar áreas en forma de manchas o bandas oscuras y deprimidas, de tamaño y distribución variable. En las áreas afectadas las fibras se aglutinan y ondulan por un exceso de grasa o suarda formando hilos de color amarillo, en los animales esquilados, estas zonas se ven color blanco tiza sobre la piel. Si bien la enfermedad es reconocida desde hace más de una década, no está totalmente identificado el agente etiológico de esta afección ni como se transmite entre los animales. Es probable que la lana sisal esté relacionada con una enfermedad descripta en Sud África denominada Bolo Disease causada por una especie no identificada de Corynebacterium. Dentro de este género bacteriano, los microorganismos presentan una gran diversidad, requiriéndose numerosas pruebas bioquímicas y varios días para lograr identificarlos a nivel especie. Los resultados de las pruebas varían según las técnicas y medios utilizados. Se ha desarrollado un sistema de identificación para bacilos Gram positivos corineiformes denominado API Coryne (BioMérieux, Inc., Francia). Este sistema se basa en pruebas bioquímicas estandarizadas (substratos deshidratados para la detección de 11 actividades enzimáticas y la fermentación de 8 azúcares) que generan un perfil numérico (pn) que se corresponde con una especie bacteriana. Es fácil de usar, y se obtiene el resultado en 24 hs.
El objetivo de este trabajo fue describir los hallazgos microbiológicos obtenidos de animales afectados y sanos utilizando las técnicas bacteriológicas tradicionales y evaluar el uso del sistema API Coryne, para identificar a nivel de especie los aislamientos corineiformes obtenidos.
Materiales y Métodos
Se realizaron hisopados de piel de ovinos Merino de una majada experimental compuesta por 10 animales afectados con lana sisal provenientes de diferentes establecimientos de la Patagonia y 11 animales sanos (controles). Los hiposos se frotaron firmemente sobre la piel afectada de los enfermos y piel sana de los controles. Luego se sembraron en placas de Agar Sangre Columbia, se incubaron a 37ºC
con 5% de CO2 y se observaron a las 48 hs. Se
repicaron las colonias más representativas para la tinción de Gram, observación al microscopio y realización de las pruebas bioquímicas tradicionales. Las colonias que tanto macro como microscópicamente coincidieron con Corynebacterium (puntiformes, circulares, bordes enteros, blanco-amarillentas, levemente brillantes, convexas y no hemolíticas, bacilos grampositivos, pleomórficos, dispuestos en grupos semejantes a letras chinas o en empalizada) se seleccionaron para su identificación con API Coryne. En este último se utilizaron cepas control ATCC (C. renale, T. pyogenes y P. acnes) y aislamientos propios (C. pseudotuberculosis y C. bovis) y se procedió según la metodología descripta por el fabricante.
Resultados
Se obtuvieron 16 aislamientos de los cuales 10 coincidieron con las características macro y microscópicas de Corynebacterium (Foto 1 y 2). Esta bacteria corineforme fue aislada de todos los animales afectados en mayor proporción que las demás colonias presentes y en algunos casos hasta en pureza, mientras que no fue aislada en ninguno de los animales controles. En algunas cepas aisladas se evidenció el desarrollo de dimorfismo, distinguible a las 48 hs de incubación. Los resultados de las pruebas bioquímicas tradicionales permitieron identificarlas como pertenecientes al género Corynebacterium pero no se logró determinar la especie (Tabla 1). Los 6 aislamientos restantes resultaron contaminantes ambientales o sin importancia veterinaria (S. epidermidis, Bacillus sp.).
Foto 1. Colonias de Corynebacterium sp.
Foto 2.Corynebacterium sp al microscopio.
Tabla 1. Pruebas bioquímicas realizadas a los aislamientos corineformes.
Prueba bioquímica Resultado
enzima oxidasa - enzima catalasa + metabolismo O/F -/- movilidad - reacción en Kligler* -/-/-/- enzima ureasa + indol - nitrato - gelatina - glucosa/lactosa maltosa/manosa celobiosa/sacarosa Todas - *glucosa/lactosa/producción de gas/producción de SH2 Con el sistema API Coryne, los 10 aislamientos corineiformes fueron identificados como C. bovis, 16 con el pn 4101004 y 1 con el pn 4501004 (difirieron en la prueba de β galactosidasa) (Foto 3). Las cepas ATCC y propias utilizadas como controles arrojaron patrones numéricos coincidentes en un 100% con las especies nombradas.
Foto 3. Resultado API Coryne para C. bovis.
Discusión
Los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas tradicionales permitieron identificar el bacilo corineforme aislado de animales afectados con lana sisal como perteneciente al género Corynebacterium, aunque no se logró llegar al nivel de especie. A fin de poder clasificar esta bacteria por medio de la bacteriología tradicional, se debería ampliar el esquema de pruebas bioquímicas, sin descartar el uso de técnicas de biología
molecular, como la PCR, para logar su identificación final. Estos resultados coinciden con lo descripto por otros autores que indican que la identificación tradicional de las corinebacterias es lenta por el gran número de pruebas bioquímicas que se deben realizar y las discrepancias encontradas en la bibliografía.
Con la utilización de sistema API Coryne fue posible obtener un perfil numérico inequívoco de todas las cepas aisladas de animales afectados identificado como C. bovis. Todas las cepas utilizadas como controles resultaron identificadas correctamente demostrando la confiabilidad del API Coryne. Además permitió obtener un resultado rápido (menos de 48 hs). En relación al desarrollo de dimorfismo en algunos aislamientos, éste fue descripto anteriormente para C. bovis, fortaleciendo el resultado obtenido.
El hecho de que C. bovis haya sido aislado sólo de los animales afectados, en algunos casos inclusive en condiciones de pureza, es un fuerte indicativo de su posible rol como agente etiológico de esta enfermedad. Sin embargo para poder confirmar esta sospecha se debería seguir trabajando para lograr la reproducción experimental de la enfermedad en animales sanos y además determinar las vías de contagio entre los animales.
El uso del sistema API Coryne, es de gran utilidad a la hora de identificar bacterias corineiformes, no solo por la confiabilidad en los resultados obtenidos, sino también por la rapidez con la que se llega a una identificación a nivel de especie.
Bibliografia
-Olaechea FV; Robles CA; Uzal FA, Duga L. 1992. “Lana sisal” o “lana manchada”: una afección de ovinos patagónicos. XII Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias. Chile.
-Joubert JP, Henton MM, Whitehead CJ, Kellerman GE. 1995. Artificial transmission of Bolo disease in woolled sheep and attempted characterisation of the causative unclassified Corynebacterium sp. J. S. Afr. Vet. Assoc. 66(4):222-229.
-Freney J., Duperron M.T., Courtier C., Hansen W., Allard F., Boeufgras J.M., Monget D. and Fleurette J. 1991. Evaluation of API Coryne in Comparison with Conventional Methods for Identifying Coryneform Bacteria. J. Clin. Microbiol. 29(1):38-41.
-Burr H.N., Lipman N.S., White J.R., Zheng J., Wolf F.R. 2011. Strategies to prevent, treat, and provoke Corynebacterium-associated hyperkeratosis in athymic nude mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50(3):378-388.
-von Graevenitz A., Funke G. 1996. An identification scheme for rapidly and aerobically growing gram- positive rods. Zentralbl. Bakteriol. 284(2-3):246-54.