CHAPTER 5. SIMULATION OF THE MODEL
5.3 PSOR Method
Abdala A. M.1-3; Farber, M1-2; Robles, C.3
1CONICET, Bariloche; 2Instituto de Biotecnología, INTA; 3Grupo de Salud AnimalINTA Bariloche
Introducción
La Lana Sisal es una dermatitis infecciosa de etiología incierta que afecta a los ovinos de la raza Merino de la Patagonia. Clínicamente se caracteriza por la presencia de manchones oscuros y deprimidos en el vellón, que contienen un exceso de grasa y fibras aglutinadas (Robles, 2007). En Sudáfrica se ha descripto y reproducido experimentalmente una enfermedad similar denominada Bolo disease (Joubert y col, 1995). En ambos casos se ha aislado a partir de hisopados de piel una bacteria corineforme, que no ha sido posible identificar con certeza mediante las técnicas bacteriológicas de rutina. Por identificación bioquímica tradicional y mediante el sistema API se estima que los aislamientos bacterianos podrían corresponder a la especie Corynebacterium bovis (C. bovis), bacteria involucrada en mastitis bovina. Los objetivos de este trabajo fueron: la identificación certera de los aislamientos por secuenciación el 16S ARNr, la puesta a punto de una técnica molecular por PCR para la identificación rápida y específica de los aislamientos bacterianos y la evaluación de un método de diagnóstico directo de hisopado de piel de ovinos con Lana Sisal.
Materiales y Métodos
Se trabajó con un total de 72 aislamientos bacterianos provenientes de animales afectados de Lana Sisal. Para su identificación, se secuenciaron 1393pb del gen de la subunidad 16S del ARNr de cuatro aislamientos y se asignó la especie comparando contra la base de datos GeneBank utilizando Blast (98% de similitud de secuencia). Mediante un análisis filogenético utilizando el método de máxima verosimilitud se compararon las 4 secuencias incluyendo las secuencias de la cepa de referencia de C. bovis aislada de bovinos (DSM 20582 y de C. jeikeium y C. urealyticum, por ser las especies más cercanas a C. bovis.
En base a esta identificación y para analizar el total de los aislamientos de ovinos, se puso a punto una PCR específica para C. bovis, que amplifica una región de 224pb también del 16S ARNr (modificada de Duga y col., 1998). A su vez se incluyeron en el análisis 21 aislamientos de Corynebacterium spp. obtenidos de muestras de leche de bovinos con mastitis (Laboratorio LactoDiagnóstico Sur). Para determinar la especificidad de la PCR se utilizó
como control ADN de otras especies de corinebacterias. Se determinó el límite de detección de la técnica diagnóstica, utilizando como templado diluciones seriadas al décimo de ADN de uno de los aislamientos de ovinos. Luego, se probó un método de detección molecular a partir de muestras directas de hisopados, sin necesidad de cultivo, donde además se omite el paso de extracción de ADN. Se utilizó el Kit de Thermo Fisher Plant Phire Direct PCR, según instrucciones del fabricante con adaptaciones. Para evaluar esta técnica se realizó un muestreo a campo en donde se hizo una revisación clínica de ovinos pertenecientes a un establecimiento ubicado en cercanías a Comallo, Rio Negro. De 11 animales identificados como afectados, se tomaron hisopados de piel de cada uno, de una zona afectada y otro de una zona sana. Además, se tomó un hisopado de piel de 5 animales clínicamente sanos como controles. Se cultivó un hisopo de una zona enferma y otro de una zona sana de cada uno de los 11 animales en el laboratorio de microbiología y los mismos hisopos se procesaron con el Kit y se les realizó la PCR descripta.
Resultados
Mediante el análisis genético realizado, se estableció que la bacteria aislada de animales con lesiones de Lana Sisal corresponde a la especie Corynebacterium bovis (C. bovis). El alineamiento múltiple de las secuencias no reveló polimorfismos de nucleótido único (SNPs) consistentes que diferencien las 4 cepas ovinas de la cepa bovina de referencia de esta especie, aislada de bovinos con mastitis. Al realizar el análisis filogenético (Figura 1), todas las cepas aisladas de casos clínicos de Lana Sisal se agruparon en un cluster que contiene a la cepa de referencia de C. bovis. Este grupo se separa claramente de las cepas del grupo de C. urealiticum (Bootstrap value 100).
La PCR utilizada arrojó resultados positivos sobre el ADN extraído del total de los 72 cultivos de aislamientos de casos clínicos de Lana Sisal. Los aislamientos de Corynebacterium spp. de leche bovina también resultaron positivos a la PCR diagnóstica. La especificidad de la técnica (Figura 2) se comprobó mediante el resultado negativo a la amplificación de ADN de otras especies de corinebacterias. El límite de detección de esta
Figura 1. Árbol filogenético obtenido por método de máxima verosimilitud del alineamiento múltiple de las secuencias del gen 16S ARNr de cada bacteria indicada. Ovino 019 Ovino 025 Ovino 466 C. bovis strain DSM 20582 Ovino 007 Corynebacterium jeikeium NCTC 11913
Corynebacterium urealyticum strain DSM 7109 13
100
0.005
Figura 2. Productos de PCR en gel de agarosa teñidos con Gel Red utilizando como templado ADN de: 1 y 2: cepas de ovinos, 3 y 4: cepas de bovinos, 5: C. pseudotuberculosis, 6: C renale, 7: C freneyi, 8: T. pyogenes, 9: control negativo, M: Marker.
Luego de poner a punto la PCR para la identificación de C. bovis desde cultivos bacterianos, se procedió a probarla sobre muestras directas.
Al cultivar los hisopados de piel del muestreo realizado en la localidad de Comallo, se observó crecimiento positivo, compatible con C. bovis tanto en morfología de colonia como en tinción de Gram, en 10 de las 11 muestras provenientes de zonas afectadas. Por su parte, no hubo crecimiento positivo en cultivos de ninguna zona sana de esos mismos animales ni de hisopados de piel de los animales controles clínicamente sanos.
Al realizar el diagnóstico molecular que consiste en el procesamiento directo de los mismos hisopos con el Kit de Thermo Fisher Plant Phire Direct PCR, y la aplicación de la PCR descripta sobre esos extractos, se detectó C. bovis en todos los hisopados de zonas afectadas de las 11 muestras y se obtuvo resultado negativo en zonas sanas y animales controles (Figura 3).
Figura 3. Gel de Agarosa teñido con GelRed de la PCR del Kit con los siguientes productos de PCR sembrados en las calles de izquierda a derecha: 1- 11 Zona enferma de animales afectados, C+ ADN de cepa de C. bovis, C- ADN de cepa de C. pseudotuberculosis, (-) agua, M: Marker.
Discusión
El análisis genético de los aislamientos obtenidos de lesiones de Lana Sisal, permitió identificarlos fehacientemente como C. bovis siendo el primer reporte del aislamiento de esta especie en ovinos. En el gen analizado no se detectaron diferencias con la cepa de referencia de C. bovis aislada de bovinos, lo que no descarta diferencias genéticas en otras regiones del genoma.
La PCR puesta a punto permite realizar la identificación de aislamientos de C. bovis provenientes de muestras tanto de ovinos como de bovinos. Por su parte se desarrolló un método que permite el diagnóstico molecular de hisopados de forma directa sin necesidad de cultivo ni extracciones de ADN complejas.
Conclusión
El método de diagnóstico molecular puesto a punto permitió realizar la identificación de C. bovis de forma rápida y directamente de la muestra de hisopado tomada a campo. Esta técnica podría reemplazar a la identificación tradicional mediante pruebas bioquímicas que para corinebacterias es dificultosa, en general no permite arribar a una clasificación certera y requiere varios días de trabajo.
Bibliografía
-Robles, C. 2007. South America: Patagonia. In: Di- seases of sheep, Ed. Aitken, Blackwell, UK, 610 pág. -Joubert, JP, Henton, MM, Whitehead, CJ, Kellerman, GE. 1995. Artificial transmission of Bolo disease in woolled sheep and attempted characterisation of the causative unclassified Corynebacterium sp. JSAfrVet Assoc, 66 (4):222- 229.
-Duga S, Gobbi A, Asselta R, Crippa L, Tenchini ML, Simonic T, Scanziani E. (1998) Analysis of the 16S rRNA gene sequence of the coryneform bacterium associated with hyperkeratotic dermatitis of athymic nude mice and development of a PCR-based detection assay. Mol Cell Probes, 12 (4): 191-199.