Existen variables a tener en cuenta para la estandarización de una PCR en tiempo real. Principalmente estas variables son la eficiencia de la amplificación, la exactitud, la reproducibilidad, la especificidad y la sensibilidad (Walker J. y Gingold E, 1997; Griffiths K. et. al., 2004; Trapman S., et. al., 2009; ENGL, 2011b). Teniendo en cuenta que la
fuente de los métodos son protocolos validados, existen algunas variables las cuales no es necesario evaluarlas para ser más eficiente la verificación. Específicamente para un método de detección de OGM cualitativo, únicamente es necesario determinar la especificidad y la sensibilidad del método (ENGL, 2011b), cuando se trabajan a partir de métodos validados previamente siempre y cuando no haya modificaciones al protocolo inicial. Sin embargo, tampoco es necesario determinar la especificidad del método debido a que ya esa variable se determinó anteriormente en el protocolo original de validación, pero es una herramienta importante para determinar el potencial de generación de falsos positivos y falsos negativos del método (ENGL, 2011b). Teniendo en cuenta que existe el procedimiento para la validación y verificación de los métodos de detección de OGM por PCR en tiempo real (ENGL, 2011b), no existe información relacionada para validación o verificación de HRM ni para PCR-HRM, independiente de la matriz que se desee utilizar o que sean métodos de detección de OGM. Existen algunas aproximaciones para la validación de HRM como las desarrolladas por Norambuena P. y colaboradores (2009) en la cual se realizó la validación de HRM de pequeños amplicones para la identificación de pequeñas variantes del gen metilen tegrahidofolato reductasa (mthfr) y el trabajo de
Panichareon B. y colaboradores (2011) en el cual desarrollaron una PCR Multiplex y HRM para el análisis de detección del virus de mancha blanca, el virus de cabeza amarilla y
Penaeus monodon en camarones. Sin embargo, estos trabajos parten del diseño y
validación inicial de las secuencias de primers y sondas, por lo cual no es una aproximación
aplicable para la Multi-target de maíz del INVIMA.
Específicamente para HRM, la variable a controlar es la Tm del pico. Esta Tm está influenciada por tres factores principalmente: la concentración de Guanina – Citocina (G- C), la concentración de MgCl y la concentración inicial del ADN para la amplificación (Gundry C., et. al., 2003; Taylor S. et. al., 2010; García M., et. al., 2012). La
concentración G-C influencia termodinámicamente la estabilidad de las cadenas de ADN aportando mayor estabilidad y directamente genera una mayor Tm para los fragmentos de análisis (Gundry C., et. al., 2003; García M., et. al., 2012). Sin embargo la Tm es
característica de cada fragmento y para el caso específico de HRM, lo importante es que el resultado sea reproducible y discriminable para identificar técnicamente los positivos de los negativos. Por otro lado, la concentración de MgCl favorece el intercambio termodinámico y la estabilidad de fragmento de ADN doble cadena (Schütz E. y Von Ahsen N., 2009); sin embargo, la concentración de MgCl es inversamente proporcional a la Tm y a la profundidad del pico (Taylor S., et. al., 2010; Gallego F. y Arjona R., 2012). Por lo
anterior, se estandariza la concentración de MgCl cuando no se obtienen picos diferenciados o cuando no se logra un mínimo de asociación entre los resultados. Finalmente, asumiendo que se controla el error relativo asociado al pipeteo y a la concentración uniforme entre muestras, la concentración inicial de ADN para la amplificación, afecta la dispersión de los picos y por consiguiente el agrupamiento para emitir un resultado por HRM generando falsos negativos (Gundry C., et. al., 2003;
Norambuena P, et. al.,2009; Taylor S. et. al., 2010; García M., et. al., 2012).
De acuerdo al montaje realizado como parte de la estandarización de la PCR-HRM para el
Screening de la Multi-target de maíz (Figura 18 y 19), se puede observar para cada uno de
los Dúplex (pFMV-p35S y tNOS-pACT) amplificación de los analitos de acuerdo a los resultados teóricos de presencia/ausencia del promotor o terminador de la prueba, se evidencia la agrupación de los resultados por el análisis de de Melt Curve Genotyping bajo
las condiciones recomendadas del Software LightCycler 480 SW 1.5 y la formación de picos fácilmente diferenciables tanto visual como dinámicamente para el análisis de genotipificación (Vossen R., et. al., 2009; Roche. 2010b). Sin embargo, teniendo en
cuenta que los protocolos para PCR se encuentran validados y que la idea es realizar un proceso eficiente, la variable que afecta directamente la amplificación y la dispersión de los picos para la PCR-HRM es la concentración de ADN.
Figura 18. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) del dúplex pFMV-
p35S.
Teniendo en cuenta que las fuentes de los protocolos definidos como bases para el diseño y validación de Multi-target de maíz se encuentran validadas para la PCR, se determinó como variable a estandarizar para PCR-HRM únicamente la concentración de ADN. Es importante aclarar, que la concentración de MgCl como una variable a estandarizar se utiliza cuando no se obtiene la formación de picos esperados (Schütz E. y von Ahsen N., 2009; Vossen R., et. al., 2009; Roche. 2010b). Específicamente para los análisis
preliminares del Screening de la Multi-target de maíz, se obtuvieron picos diferenciables
visualmente, pero con un bajo nivel de agrupación asociado a la concentración inicial de ADN para la PCR (Gundry C., et. al., 2003; Taylor S. et. al., 2010; García M., et. al.,
2012). Por tal razón, se evaluaron concentraciones oscilantes entre la mayor concentración de ADN reportada por el Compendium of reference methods for GMO analysis (200
ng/reacción) y la concentración que se tiene validada por el laboratorio (40 ng/reacción) la cual es considerada como la concentración mínima recomendada por el fabricante del equipo para la HRM (Roche, 2010b).
b. b.
c. c.
Figura 19. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) del dúplex tNOS-
pACT.
5.3.3. Parámetros de análisis de Melt Curve Genotyping para el Screening de la