4.1. Diseño del método Multi-target de maíz
Para diseñar el método se partió específicamente del alcance que se tenía planteado. El método debe identificar el gen de referencia para maíz, un método de Screening
significativo de cuatro elementos específicos para poder identificar o descartar algunos eventos de transformación genética y ocho identificaciones evento específicas. Adicionalmente, el método debe ser eficiente en el uso de los recursos y armonizado con el esquema de detección del laboratorio.
Para definir que gen de referencia debe detectar la multi-target de maíz, se revisaron bases de datos para conocer cuáles son los más utilizados y eficientes al realizar la detección de OGM. Para los elementos específicos y los eventos de transformación genética que debe detectar la Multi-target, se realizó un análisis de composición de los insertos de los eventos de maíz aprobados en el país y se realizó un análisis de composición de los eventos que componen todas las solicitudes presentadas por las empresas biotecnológicas al Comité Técnico Nacional en Bioseguridad (CTNSalud).
Una vez definido el gen de referencia, los elementos específicos y los eventos que debe detectar la Multi-target de maíz, se definieron los métodos y secuencias teniendo en cuenta que todos deben anillar y extender a la misma temperatura y tiempo, y adicionalmente que el método se encontrara validado para aumentar su confiabilidad.
4.2. Primers y sondas
Todos los primers y sondas fueron sintetizados para una concentración final de 100
pmol/µl, purificados por HPLC y analizados por MALDI-TOF y HPCE como control de calidad, por Bioneer en Alameda California (USA). Las sondas utilizadas son tipo Taqman. Todas las sondas (exceptuando la sonda para p35S, pACT y MON89034) fueron marcadas con 6-carbosyfluoresceina (FAM) y 6-carboxytetrametilrodamina (TAMRA) en el extremo 5´y 3´ respectivamente. Las sondas de p35S y pACT fueron marcadas con 5-Hexacloro- fluoresceina fosforamidita (HEX) y TAMRA en el extremo 5´y 3´respectivamente. La sonda MON89034 fue marcada con FAM en el extremo 5´ y en el extremo 3´un ligando de unión al surco menor MGB (por sus siglas en inglés: Minor Groove Binder) y nonquenched fluorescent 3` (NQF3´). Todas las soluciones de primers, sondas, diluciones a soluciones
4.3. Materiales de Referencia y certificados para la validación
Para la validación de la Multi-target de maíz se utilizaron Materiales de Referencia producidos por el IRMM (por sus siglas en inglés Institute for Reference Materials and Measurements) de la Joint Research Centre de maíz MON810 9.90% y 0.49% (ERM®-
BF413gk y ERM®-BF413ck respectivamente), maíz Bt11 0.49% (ERM®-BF412c), maíz NK603 0.1% (ERM®BF415b), maíz TC1507 0.99% (ERM®-BF418c), Soya GTS 40-3-2 10.00% (ERM®-BF410gk) y Algodón 281-24-236x3006-210-23 0.0% (ERM®BF422A). Materiales Certificados de Arroz cultivar Fedearroz 473 pila 3 del LANASE (Laboratorio Nacional de Semillas) del ICA. Material Certificado de Syngenta Crop Protection de maíz Bt11, maíz GA21 y maíz MIR604. Material Certificado de Monsanto Company de maíz NK603, MON89034xNK603 y MON88017. Material Certificado de DuPont TC1507.
4.4. Acondicionamiento de la muestra y Extracción de ADN
Para los materiales de referencia utilizados en el diseño y la validación de la Multi-target de maíz, no fue necesario realizarles ningún acondicionamiento, de acuerdo a que el material se encuentra molido y a un tamaño de partícula adecuado para realizar una extracción exitosa. Los Materiales Certificados, a excepción del material de arroz, se molieron tomando 500 gr de la muestra en las ollas de molienda de 3 litros (PI063) del
molino de bolas (V.1 OrtoAlresa) con 20 bolas de 25 mm de acero inoxidable por 35 minutos. El Material Certificado de arroz, se molió tomando 50.44 g de la muestra en la olla de molienda de 1 litro (PI062) en el molino de bolas (V.1 Ortoalresa) con 10 bolas de 17 mm y 10 bolas de 25 mm de acero inoxidable por 45 minutos.
La extracción de ADN de todos los materiales se realizó con el Kit de extracción de ADN de alimentos NúcleoSpin® Food (Cat 740945.250) bajo el procedimiento recomendado por el fabricante a excepción de la elución. La elución se realizó vertiendo 50 µl del buffer de Elución CE sobre el filtro de la columna del kit de extracción de ADN, se deja incubar por 5 minutos y se centrifuga 1.5 minutos a 11.000 g. La solución de ADN extraído fue cuantificada con el NanoDrop 2000 bajo el protocolo de cuantificación de Ácidos nucleicos tipo ADN-50. Una vez cuantificada, se preparó la solución de ADN para amplificación a 400 ng/µl en agua grado molecular Mobio (Cat. 17012-5200). Todas las diluciones de ADN para la evaluación de la sensibilidad se realizaron en agua grado molecular Mobio (Cat. 17012-5200).
4.5. Condiciones de PCR-HRM
La PCR y la genotipificación por High Resolution Melting se llevó a cabo en placas de 96
pozos (Cat. 04729692001) en el LightCycler 480 II (Roche) en reacciones de 10 µl que contienen 80 ng/µl de ADN, máster mix QuantiTect Probe PCR (Catalogo 204343) (Qiagen). La concentración de primers y sondas se utilizó de acuerdo a la tabla 7. El
programa de PCR utilizado fue 50°C por 2 minutos, seguidos por 95°C por 15 minutos, y luego 45 ciclos de 94°C por 15 segundos y 60°C por 60 segundos. Finalizado el programa
de PCR, se inicia el programa de HRM con 95°C por 1 minuto, 42°C por 2 minutos y un calentamiento hasta 95°C con rampa de 0.06°C/S y 5 adquisiciones de fluorescencia por cada °C.
Tabla 7. Concentraciones de trabajo de los primers y las sondas utilizadas en la Multi-target de maíz.
Amplicón del método Primer Forward (µM) PrimerReverse (µM) Sonda (µM) Bibliografía
hmgA 0.3 0.3 0.18 Mazzara M., et al. 2005a.
pFMV 0.5 0.5 0.2 Bahrdt C., et. al. 2010.
p35S 0.75 0.75 0.15 Zeitler R., et. al., 2002.
tNOS 1.0 1.0 0.2 Waiblinger H., et. al., 2008.
pACT 0.3 0.3 0.15 Mano J., et. al., 2009.
MON89034 0.45 0.45 0.1 Savini C., et al., 2008.
MON88017 0.15 0.15 0.05 Charles C., et al., 2008.
NK603 0.6 0.6 0.3 Mazzara M., et al., 2005b.
MON810 0.5 0.5 0.25 Mazzara M., et al., 2006.
Bt11 0.75 0.75 0.25 Mazzara M., et al., 2005c.
GA21 0.9 0.9 0.2 Charles C., et al., 2007.
MIR604 0.6 0.3 0.2 Mazzara M., et. al., 2010.
TC1507 0.3 0.3 0.18 Mazzara M., et al., 2005a.
A todas las corridas se les montó un control positivo, un negativo y un control de reactivos.
4.6. Verificación preliminar de primers y sondas
La verificación preliminar de primers y sondas se realizó para pFMV, p35S, tNOS, pACT,
MON89034, MON88017, Bt11, GA21 y MIR604 realizando la extracción de ADN de algunos de los materiales considerados positivos y negativos para la diana de amplificación y realizando la amplificación a 50°C por 2 minutos, seguidos por 95°C por 15 minutos, luego 45 ciclos de 94°C por 15 segundos y 60°C por 60 segundos, y finalmente 40°C por 30 segundos. A los primers y sondas de hmgA, NK603, MON810 y TC1507 no se les
realizó la Verificación preliminar debido a que son secuencias que se encuentran validadas a nivel cuantitativo y se encuentra evaluada su especificidad bajo las condiciones técnicas del laboratorio (Phandanouvon V, 2010; Phandanouvong V, 2011; Phandanouvong V, 2012).
4.7. Estandarización de PCR-HRM
Para estandarizar PCR-HRM se montaron pruebas cortas de Especificidad con la diana de amplificación a concentración del 100% para analizar el efecto de fluorescencia residual. Una vez que se evidenció que no se cuenta con efecto residual que afecte la confiabilidad del método, se analizaron cuales criterios de evaluación para la estandarización de la PCR- HRM son representativos y susceptibles de estandarización para garantizar la viabilidad del
método. Los criterios de evaluación para la estandarización fueron: Desviación Estándar de los Cp de la Amplificación, Agrupamiento de los resultados en de la HRM y Homogeneidad de picos de la HRM. Al definir cuales criterios importantes, se determinó la estrategia para lograr estandarizar PCR-HRM.
4.8. Validación de la Multi-target de maíz
Se evaluó la especificidad para cada parte de la Multi-target de maíz. Para evaluar la especificidad del Gen de referencia, se analizó con muestras de Arroz, Soya y Algodón con dos extracciones por matriz analizada dos veces en duplicado a 80 ng de ADN por reacción. Adicionalmente, se evaluó la especificidad y el comportamiento de los primers y sonda
para HRM con los OGM involucrados dentro del alcance de la Multi-target con una extracción por duplicado 80 ng de ADN por reacción. Por otro lado, para evaluar la especificidad del Screening de la Multi-target de maíz, se analizó con dos extracciones de
cada uno de los eventos dentro del alcance del método dos veces en duplicado 80 ng de ADN por reacción. Finalmente, para evaluar la especificidad de las secuencias para la detección Evento específica, se analizaron todos los OGM dentro del alcance del método por duplicado 80 ng de ADN por reacción.
Para evaluar la Sensibilidad del método se simularon muestras a concentración de 0.2, 0.1 y 0.05 copias para el Gen de referencia, y 0.1%, 0.05% y 0.025% para determinar la sensibilidad del método para el Screening y la detección Evento específica.
4.9. Comparación de la Multi-target de maíz del INVIMA con otras Multi-target existentes
La JRC publicó en β009 “Real-time PCR-based ready-to-use multi-target analytical system for GMO detection” la cual detecta 47 secuencias entre Genes de Referencia, Elementos
específicos y Eventos específicos. De igual forma, Mano J. y colaboradores en 2009, publicó “Real-time PCR array as a universal platform for the detection of Genetically Modified crops and its application in identiflyin unapproved Genetically Modiflying crops
in Japan” la cual detecta 30 secuencias entre Genes de Referencia, Elementos específicos y
Eventos específicos. Finalmente, Klugla L. y colaboradores, en β011 publican “A ready-to- use multi-target analitycal system for GM soy and maize detection for Enforcement Laboratries”, detecta 20 Eventos específicos entre maíz y soya y dos Genes de Referencia.
Se realizó una comparación teórica entre estas tres Multi-target con la desarrollada por el INVIMA. Se analizó la eficiencia del método en términos del mejor aprovechamiento de recursos como reactivos y tiempo de análisis posteriores para confirmación de resultados. De igual forma, se analizó la representatividad de los resultados en función del número de sub-muestras y réplicas analizadas para emitir un resultado veraz y confiable. Finalmente, se evaluó el alcance del método y el control de falsos positivos y falsos negativos.