2.1-Tipo del estudio
Se evaluaron trabajadores del Hospital Pediátrico Universitario“José Luis Miranda” en un estudio de casos y controles de corte transversal en el campo de la Genética Toxicológica. En específico, estudio de genotoxicidad in vivo mediante el ensayo de MN como biomarcador de efecto, para establecer y caracterizar el efecto potencial de exposición ocupacional. Son controladas otras co-variables de riesgo, realizando un estudio de asociación de la influencia simultánea de estos factores sobre la frecuencia en formación de MN en los grupos poblacionales expuestos y no expuestos estudiados. Los trabajadores que accedieron a participar en el ensayo se distribuyeron en ambos grupos. Antes de la realización de cualquier procedimiento, los sujetos potenciales a incorporarse al estudio recibieron una explicación clara sobre los objetivos del estudio, el riesgo, los beneficios y el carácter voluntario de su participación. Los mismos manifestaron su consentimiento por escrito, el cual se basó en la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial y los reglamentos gubernamentales e institucionales ((WMA), 1964, (CIOMS), 1993). El grupo expuesto incluyó los trabajadores manipuladores de citostáticos y el grupo no expuesto se conformó con trabajadores cuyas funciones no implican interacción alguna con este tipo de medicamentos.
La selección de cada grupo estuvo determinada por la disponibilidad de voluntarios, y el cumplimiento de los criterios de inclusión y exclusión, siendo excluidos aquellos con enfermedad oncológica, con tratamiento radioterápico o de quimioterapia, o que no respondieron al cuestionario.
2.2- Población estudiada
La población estudiada estuvo constituida por 57 individuos de la provincia de Villa Clara trabajadores del Hospital Pediátrico Universitario “José Luis Miranda”, dividido en dos grupos, diferenciados por su exposición en su ambiente laboral a fármacos citostáticos ya sea por preparación, manipulación, o administración.
22
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”
Materiales y Métodos
2.2.1- Individuos expuestos
El grupo expuesto (GE) se conformó por 30 trabajadores de ambos sexos, del Hospital Pediátrico Universitario “José Luis Miranda”, pertenecientes a los Servicios de Farmacia y Onco-hematología, con más de 1 año en el puesto de trabajo.
2.2.2- Individuos no expuestos
El grupo no expuesto (GNE) estuvo integrado por 27 individuos del Hospital Pediátrico Universitario “José Luis Miranda” con un ámbito laboral libre de exposición a medicamentos citostáticos, conformado por trabajadores de los Departamentos de Contabilidad, Estadística, Personal y Laboratorio Clínico.
2.3- Cuestionarios
Los individuos se consultaron para conocer el interés y libre voluntad de colaborar y formar parte del estudio, de estar de acuerdo, firmaron un consentimiento informado (Anexo 1).
Después de las charlas informativas a los trabajadores, paralelamente a la extracción de las muestras biológicas, y para tener un buen conocimiento de las características, tanto del colectivo expuesto como del no expuesto, cada donante se sometió a una encuesta exhaustiva (ver Anexo 2). Este documento se diseñó con la finalidad de obtener la información detallada, directamente relacionada con la exposición y los factores que caracterizan los antecedentes personales de cada sujeto.
En líneas generales, comprende las siguientes secciones:
Datos personales
Exposición laboral: con todo lo referente desde perfil ocupacional, diferentes agentes tóxicos expuestos, hasta información detallada de la forma de manipulación de los citostáticos, medios de protección, cuidados frente a derrames, lugar de preparación de los citostáticos y ocupaciones previas con exposición a agentes tóxicos.
Ocupación actual - Descripción, riesgos laborales, exposición a agentes, antigüedad laboral
23
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”
Materiales y Métodos
Residencia Actividades de tiempo libre: abarcó la exposición a otros agentes que son utilizados en diversas actividades fuera de su ámbito laboral.
Hábitos
Tabaco - Observaciones
Consumo de alcohol - Observaciones
Consumo de té o café - Observaciones
Historia médica
Antecedentes familiares
Antecedentes personales - Enfermedades frecuentes, ingestión habitual de medicamentos
En este punto, además de una detallada anamnesis acerca de los antecedentes personales (enfermedades crónicas, congénitas, medicación, etc.) y familiares (datos sobre fertilidad, referencias de la descendencia), se efectuó también una completa exploración física.
En todos los puntos que comprende la encuesta realizada, se ha tratado de identificar cualquier factor que pueda confundir los resultados obtenidos en el análisis de anomalías cromosómicas.
Las encuestas fueron codificadas antes de la introducción de la información en la base de datos y posteriormente se procedió a su análisis. Así, se obtuvo la descriptiva poblacional de cada uno de los grupos de estudio y luego se efectuó el estudio con los resultados obtenidos de las muestras biológicas recogidas.
2. 4- Obtención y preparación de las muestras
Todas las muestras biológicas se tomaron durante el transcurso del primer trimestre del 2017. A los trabajadores se les dieron instrucciones de no consumir, durante una semana previo a la toma de la muestra, bebidas alcohólicas, cafeína, té o cigarro. Se recolectaron muestras de sangre para la determinación de parámetros bioquímicos y de mucosa bucal para el ensayo citogenético.Las muestras de sangre fueron extraídas en ayunas con ayuda de una aguja tipo mariposa de calibre 20, adquiriéndose 5 mL de sangre periférica total por individuo. Este procedimiento se
24
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”
Materiales y Métodos
realizó por personal especializado del laboratorio clínico del Hospital “José Luis Miranda” y cumpliendo con las técnicas de asepsia establecidas.
Antes de obtener las muestras para el ensayo citogenético, cada donante se enjuagó la boca con agua destilada estéril para eliminar posibles restos de alimentos. Las muestras obtenidas se procesaron en el laboratorio de citogenética del Centro Provincial de Genética de Villa Clara.
Las células de descamación de la mucosa bucal se obtuvieron friccionando el interior de las mejillas, evitando tocar la lengua y los dientes, con hisopo o cepillo dental de fibra suave humedecido en solución salina fisiológica. Estas muestras fueron inmediatamente sumergidas en 15 mL de solución salina fisiológica agitando vigorosamente para obtener el mayor número posible de células. Las muestras fueron mantenidas a 4 grados hasta su posterior procesamiento.
2.4.1- Parámetros bioquímicos
La finalidad del estudio bioquímico fue detectar los posibles cambios metabólicos existentes en el organismo. Las determinaciones clásicas del laboratorio clínico sólo proporcionan una idea general del estado metabólico del paciente evaluado, sin detalles precisos de la etiología que produce los cambios. A todos los individuos participantes del estudio se les efectuó un completo análisis del perfil bioquímico, en un Autoanalizador Hitachi 902, determinando componentes del perfil hepático, renal, lipídico entre otros: TGP (Transaminasa glutámica pirúvica), TGO (Transaminasa glutámica oxalacética), GGT (Gammaglutamiltransferasa), LDH (Lactato deshidrogenasa), FAL (Fosfatasa alcalina), Colesterol, Triglicéridos, Glicemia, Proteínas totales, Creatinina y Ácido Úrico.
2.4.2- Ensayo de MN en mucosa bucal
2.4.2.1- Procedimiento
Las muestras de mucosa bucal se centrifugaron durante 10 minutos a 1500 rpm, se aspiró el sobrenadante y se añadieron 15 ml de solución tampón (0,1M EDTA, 0,01M tris-HCl, 0,02 M NaCl, pH = 7), se centrifugó durante 10 minutos 1500 rpm, repitiendo este paso hasta tres lavados. Acabado el tercer lavado, se aspiró el sobrenadante y
25
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”
Materiales y Métodos
se adicionó solución fijadora de Carnoy (Ácido Acético: metanol 1:3) fría por 5 min, se centrifugó dejando una cantidad suficiente de tampón para tener una concentración celular adecuada (34). Se gotearon 6 gotas de 50μL del botón celular sobre portaobjetos (2 por muestra) calentados en una placa calefactora a 55℃ durante 15 min y se dejaron secar durante otros 15 min en la placa calefactora. Una vez que estaban bien secas, se guardaron a -20℃ hasta su evaluación.
Las preparaciones secas se tiñeron con una solución al 10% de Giemsa durante 10 minutos. Después de lavadas (con agua de la llave) se secaron al aire, y una vez secas se sellaron con cubreobjetos (24 x 60 mm) utilizando Entellan. Los portaobjetos, fueron codificados previamente, ya que mediante el estudio “a ciegas” se evita subjetividad en el análisis. La observación se hizo con aumento de 1000 X con ayuda de un microscopio de campo claro (Fig. 2).
El número de células con MN por individuo se obtuvo del conteo de 1000 células. Para considerar que estábamos en presencia de MN seguimos los criterios de Tolbert (35), debía cumplirse que el diámetro de los mismos fuera menor de 1/3 del tamaño de los núcleos, que la coloración fuera semejante a la de los núcleos principales y que el MN estar totalmente separado o solo superponerse parcialmente a uno de los núcleos principales.
26
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”
Materiales y Métodos
Figura 2. Esquema de protocolo de ensayo de MN en mucosa bucal
2.5- Análisis estadístico
Para llevar a cabo el análisis estadístico, se confeccionó una base de datos que incluía toda la información recopilada a través de la encuesta y los resultados de los análisis de las muestras realizados en el laboratorio. La base de datos se confeccionó utilizando el paquete estadístico SPSS versión 21.0.
La normalidad de los datos, fue determinada mediante la prueba de Kolmogorov- Simirnov (de una muestra) en cada uno de los grupos.
Se realizó la estadística descriptiva de las diferentes variables demográficas, estilos de vida, exposición ocupacional para los grupos: expuestos y no expuestos.
Mediante el estadígrafo T de Students se compararon ambos grupos muestrales en cuanto a las co-variables seleccionadas en el estudio. La asociación entre dos variables discretas fue analizada usando el test de Chi cuadrado, el cual fue usado para comparar frecuencias entre grupos.
27
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”
Materiales y Métodos
Para determinar los factores de riesgos asociados con el daño genético determinado por la incidencia de MN se usó la técnica de árbol de decisión CHAID (Chi-squared Automatic Interaction Detector) basado en el estadígrafo chi-cuadrado.
En el estudio se consideraron como factores de riesgos, la edad, sexo, ocupación, años de exposición ocupacional, riesgos en puesto de trabajo actual y previo, lugar de residencia y riesgos asociados a este y a estilos de vida: consumo de alcohol, tabaco, café, dietas, enfermedades previas al estudio, antecedentes familiares, etc. Todos los análisis estadístico fueron realizados con el SPSS, versión 21,0 y se consideró un nivel de significación de α ≤ 0.05.
Para la estimación del riesgo en las variables que resultaron tener asociación significativa con la variable objeto de estudio se empleó el modelo estadístico el Odd Ratio y su intervalo de confianza al 95% (OR-IC) El cálculo del Odd Ratio fue realizado en base a la elaboración de tablas de contingencia de 2x2 de la forma habitual y los OR mayores a 1 indican mayor riesgo en los individuos expuestos.
28
Liset Castellanos Puentes
“Daño genético en trabajadores expuestos ocupacionalmente a citostáticos”