La SSF representa uno de los procesos más interesantes para la producción de enzimas de interés industrial, siendo los residuos agroindustriales los sustratos más utilizados en este proceso. En general, hay pocos estudios sobre la producción de enzimas microbianas en fermentación en estado sólido sobre residuos derivados del café y la mayoría de éstos se han
P ro te ín a (m g m L -1)
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realizado con hongos filamentosos, que producen enzimas de tipo xilanasas, acetilesterasas, catecol-oxidasas, y proteasas (Pandey y col., 2000).
En el presente trabajo se ha evaluado la producción en condiciones SSF de distintas enzimas hidrolíticas implicadas en la degradación de hemicelulosas (xilanasas y mananasas), almidón (amilasas), lípidos (esterasas), así como de enzimas oxidativas, implicadas en la oxidación de fenoles, como es la lacasa. Las enzimas se valoraron en los extractos enzimáticos obtenidos a los 10 días de incubación del sustrato fermentado, siguiendo la metodología descrita en Materiales y Métodos, y los resultados obtenidos se presentan en la Tabla I.8.
Tabla I.8. Actividades enzimáticas producidas por las diferentes cepas.
Cepa/actividad Xilanasa U g-1 Mananasa U g-1 Amilasa U g-1 Lacasa mU g-1 Esterasa mU g-1 Control 0,6 0 0 0 0 S. chattanoogensis 0,7 0 0,14 0,2 1,4 S. UAH 47 1,8 0,6 0,5 0,9 8,9 S. UAH Nic-C 16,0 0 2,8 189,0 22,2
A continuación se presentan los resultados obtenidos para cada una de las enzimas evaluadas.
I.4.5.1. Actividad xilanasa
En la Tabla I.8 se presentan los niveles de actividad xilanasa (U g-1 de sustrato) producidos por las tres cepas de Streptomyces ensayadas a los 10 días de incubación, correspondiendo los niveles más elevados de actividad a la cepa S. UAH Nic-C (16 U g-1). El nivel de actividad xilanasa producido por esta cepa sobre pulpa de café fue más elevado que el obtenido con la cepa Streptomyces chattanoogensis en cultivo sumergido y en presencia de arabinoxilano como inductor (1,3 U mL-1) (López-Fernández y col., 1995). Hay que tener en cuenta que la pulpa de café es un residuo rico en compuestos carbonados entre los que se encuentra la hemicelulosa (Salmones y col., 2005), que daría lugar tras su hidrólisis a azúcares sencillos que podrían actuar como inductores de la actividad xilanasa. La inducción de xilanasas por xilanos es una característica común en Actinomicetos y hongos, aunque la celulosa también se ha descrito como inductor en algunos microorganismos (Hrmová y col., 1989).
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto el potencial de la cepa S. UAH Nic-C para su escalado como fuente de xilanasas, con vistas a su utilización en la industria del procesamiento del café, tanto en su etapa de extracción como en la obtención del café instantáneo (Viikari y col., 1993). Estas enzimas se han utilizado también en la industria agroalimentaria, para incrementar la digestibilidad de residuos destinados a alimento animal, así como en la fabricación del pan, cerveza y extracción de aceites (Wong y Sadler, 1993).
I.4.5.2. Actividad mananasa
De las cepas ensayadas, únicamente se detectó actividad mananasa sobre pulpa de café a los 10 días de incubación en la cepa S. UAH 47 (0,6 U g-1 de sustrato) (Tabla I.8), siendo los niveles de actividad alcanzados por esta cepa en SSF superiores a los obtenidos por otras cepas de Streptomyces en cultivo sumergido y en presencia de galactomanano como inductor, como es el caso de S. ipomoea (0,242 U mL-1) y S. scabies (0,294 U mL-1) (Montiel y col.,
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1999). Aunque se ha descrito que la presencia de galactomanano en el medio de cultivo es esencial para la producción de mananasas, también se ha considerado el papel de otros inductores como la celulosa y la xilosa, lo cual podría justificar el elevado nivel de actividad mananasa detectado sobre pulpa de café, puesto que como ya se ha indicado anteriormente este residuo tiene en su composición celulosa y hemicelulosa que podrían inducir dicha actividad durante la SSF.
Las mananasas junto con las xilanasas, son enzimas muy utilizadas en los últimos años en la industria de fabricación de papel, principalmente en el bioblanqueo de las pastas de celulosa (Montiel y col., 2002). Es importante señalar que en este estudio, la cepa S. UAH 47 produjo ambas enzimas sobre pulpa de café, lo cual podría ser interesante con vistas a su aplicación biotecnológica.
Otra de las aplicaciones biotecnológicas de las mananasas es en la industria textil, donde se utilizan para eliminar las sustancias adhesivas que se añaden previamente a las fibras, para evitar que éstas se rompan en el proceso de fabricación del tejido (Pedersen y col., 1995). En la industria alimentaria, las mananasas se han aplicado en el procesamiento del café instantáneo, ya que reducen la viscosidad del mismo por hidrólisis de los galactomananos presentes en el mucílago del café. Además, se han aplicado en la industria panadera, como agentes que retardan el endurecimiento del pan. Otra de sus aplicaciones es en la producción de piensos para animales, donde se ha comprobado que producen un aumento de la digestibilidad del material de partida (Wong y Sadler, 1993).
I.4.5.3. Actividad amilasa
Del ensayo de actividad amilasa realizado en los extractos obtenidos del residuo fermentado con las distintas cepas, se puede deducir, que todas ellas producen niveles apreciables de dicha actividad, siendo en los extractos del sustrato fermentado por la cepa S. UAH Nic-C donde se detectaron los niveles más elevados (Tabla I.8).
El almidón es un sustrato frecuentemente hidrolizado por microorganismos y particularmente por hongos filamentosos en procesos SSF. De hecho, la producción de α-amilasas con fines biotecnológicos se ha llevado a cabo utilizando como sustrato diferentes residuos agrícolas, tales como, yuca, arroz, etc. En general, los residuos amiláceos resultan muy adecuados para ser utilizados en la alimentación animal, una vez fermentados con microorganismos que incrementen su contenido en proteínas en condiciones SSF. Así por ejemplo, la yuca ha sido fermentada por Aspergillus niger en SSF, con el consiguiente enriquecimiento proteico del sustrato para su utilización en la alimentación animal. Este mismo residuo amiláceo ha sido fermentado con distintas cepas de Rhizopus para la producción de SCP (Single-Cell-Protein). Especialmente la yuca ha sido fermentada con A. niger en SSF para conseguir su enriquecimiento proteico y así poder utilizarla en la alimentación animal, y con cepas de
Rhizopus para producir SCP (Raimbault, 1998).
En el trabajo que se presenta, la yuca se ha utilizado como co-sustrato de la pulpa de café para favorecer el crecimiento de las cepas de Streptomyces, ya que se ha comprobado que estos microorganismos requieren la presencia de otra fuente de carbono más fácilmente accesible para poder desarrollarse en condiciones SSF sobre pulpa de café.
Las amilasas son enzimas que presentan además gran interés biotecnológico, destacando entre otras, su aplicación en la clarificación de zumos de frutas y en la producción de azúcares
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fermentables a partir de residuos agrícolas. Estas enzimas también tienen su aplicación en la industria papelera, concretamente en el reciclado de varios tipos de papel (Kirk y Jeffries, 1996).
I.4.5.4. Actividad esterasa
Dada la presencia de lípidos en la pulpa de café control (Figura I.10), se suscitó el interés por conocer si las cepas de Streptomyces seleccionadas para este estudio, producían actividad esterasa de tipo lipasa cuando se cultivan sobre este residuo en condiciones SSF.
En los extractos enzimáticos procedentes del residuo fermentado por las distintas cepas, se detectó la presencia de actividad esterasa sobre el sustrato p-nitrofenil butirato, siendo los niveles más elevados los correspondientes a la cepa S. UAH Nic-C (22 mU g-1 de pulpa) (Tabla I.8). Estos resultados ponen de manifiesto que la pulpa de café es un buen sustrato para la producción de lipasas, como ya se había demostrado por otros autores (Boopathy, 1988). Así, se comprobó que durante la fermentación anaerobia de la pulpa de café se producen en el digestor diversas enzimas, lipasas entre otras, con mayor actividad que la que se obtiene con otros residuos, como es el caso del estiércol de vacas.
Cabe destacar, que las lipasas en general, son muy versátiles como biocatalizadores y son de enorme interés por su aplicación tanto en la industria (farmacéutica, alimentaria, agroquímica y cosmética), como en la resolución de problemas medioambientales (biorremediación) (Pandey y col., 2000; Jaeger y Eggert, 2002). En la industria papelera las lipasas han adquirido recientemente una especial relevancia en la eliminación del “pitch”, nombre genérico dado a un conjunto de compuestos hidrofóbicos, resinas, triglicéridos y ceras, que causa graves problemas en el proceso de producción de pasta de papel a partir de maderas de coníferas y frondosas (Calero-Rueda y col., 2002).
I.4.5.5. Actividad lacasa
La actividad lacasa se valoró en los extractos correspondientes a los 3 días de incubación, puesto que en estudios anteriores realizados en nuestro laboratorio con la cepa S. cyaneus y paja de trigo como sustrato (Berrocal y col., 2000), se había comprobado que esta enzima se produce en los primeros días de crecimiento. En los extractos enzimáticos obtenidos a partir de los residuos fermentados por las tres cepas de Streptomyces, se ha detectado la presencia de actividad lacasa, aunque en niveles muy bajos en el caso de las cepas S. chattanoogensis (11,3 mU mg-1 de proteína) y S. UAH 47 (0,35 mU mg-1 de proteína). Sin embargo, en el caso de la cepa S. UAH Nic-C los valores de actividad enzimática fueron mucho más elevados (315 mU mg-1 de proteína) (Tabla I.8). Los niveles de actividad alcanzados por esta cepa sobre pulpa de café, fueron más bajos que los producidos por S. cyaneus sobre paja de trigo (1,2 U mg-1 de proteína) a los 2 días de incubación en SSF (Berrocal y col., 2000). No obstante, sería interesante comprobar en estudios posteriores, la producción de actividad lacasa por las cepas ensayadas durante períodos más largos de incubación, ya que no conocemos la dinámica del proceso de degradación ni la actividad metabólica de estas cepas sobre pulpa de café.
La producción de lacasas y otras enzimas oxidativas por microorganismos sobre residuos agroindustriales, como el café, tiene una gran ventaja desde el punto de vista tecnológico, puesto que como ya se ha indicado en la introducción de esta memoria, la pulpa de café tiene en su composición compuestos tóxicos como cafeína, taninos y polifenoles, que impiden su uso directo en la alimentación animal. En este sentido, se han descrito algunas bacterias de los
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géneros Pseudomonas y Bacillus y hongos de los géneros Pleurotus y Aspergillus, con capacidad para degradar la cafeína de los residuos de café en SSF, disminuyendo su toxicidad (Pandey y col., 2000). Asimismo, se ha estudiado la producción de enzimas oxidativas durante el crecimiento de hongos comestibles, como es el caso de distintas especies de
Pleurotus en SSF sobre residuos de café, y se han detectado en estas condiciones, actividades
de tipo lacasa y Mn peroxidasa, que se han asociado a la degradación de fenoles (Velázquez- Cedeño y col., 2002).
Los resultados obtenidos en nuestro estudio ponen de manifiesto, el interés potencial de la cepa S.UAH Nic-C productora de lacasa, para destoxificar los residuos del café, así como los efluentes derivados de esta industria, contribuyendo de este modo a reducir el impacto ambiental que produce su acumulación en los suelos o su vertido en el curso de los ríos. Como ya se ha comentado, el uso de los residuos de café en la alimentación animal ha estado limitado por su alto contenido en taninos, otros polifenoles y cafeína, a pesar de la presencia de otros componentes de interés nutricional, como proteínas, carbohidratos y minerales, por lo que la búsqueda y selección de microorganismos que degraden o disminuyan su contenido en compuestos tóxicos podría ser una buena alternativa para su aplicación biotecnológica (Mazzafera, 2002).
Las lacasas, por otro lado, presentan también un gran interés potencial en la industria alimentaria y en la biorremediación de efluentes derivados de esta industria, como es el caso de los producidos en el proceso de fabricación de la cerveza, destilerías y fábricas de aceite. En la industria alimentaria también se han utilizado en el procesamiento de zumos y en la estabilización de vinos (Minussi y col., 2002). Además, estas enzimas también presentan interés para la industria papelera, ya que a escala de laboratorio han demostrado su utilidad tanto en procesos de biopasteo (deslignificación del sustrato lignocelulósico de partida) como en el bioblanqueo de la pasta de papel (deslignificación de la pasta) (Berrocal y col., 2000; Arias y col., 2003). Asimismo, estas enzimas podrían ser utilizadas para la decoloración y destoxificación de efluentes de la industria papelera (Hernández y col., 1994).