La identificación de las especies confirmó los resultados de observaciones preliminares efectuadas en el sitio (Noviembre 2006). De acuerdo con el análisis en microscopio los áfidos colectados desde Cupressus sp. correspondieron a C. cupressi, en tanto que los de Thuja sp. correspondieron a C. tujafilina.
DNA extraído de individuos provenientes de colonias previamente identificadas (C. cupressi desde Cupressus sp. o C. tujafilina desde Thuja sp.) fue amplificado, clonado y secuenciado. Las secuencias de 6 clones de C. cupressi y C. tujafilina se emplearon para búsqueda en Genbank vía BLASTN. Las secuencias provenientes de C. tujafilina presentaron un 99% de identidad nucleotídica con secuencias del gen CO-I correspondientes a C. tujafilina colectada en Europa (Durak et al., 2008). Las secuencias de C. cupressi mostraron entre 91-92% de identidad nucleotídica con C. tujafilina. Las secuencias de C. cupressi generadas en el presente trabajo, son las únicas secuencias disponibles en bases de datos, y la comparación entre ambas especies muestra que las diferencias existentes permiten el desarrollo de un método molecular de identificación. Cada haplotipo único detectado se presenta en la Figura V-5; el marco de lectura se indica con tripletes alternados de letras minúsculas y mayúsculas en la primera secuencia del alineamiento.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 610 620 630 640 650 660 670 680 690 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. C. cupressi |EU881687| TttaATAataGGAtccCCTgatATAgccTTCccaCGAttaAATaatATTagaTTTtgaCTTctaCCTcctTCAttaATAatgATAattTGCagaTTTatt Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ... Put. C. cupressi |EU881692| ...C... Put. C. cupressi |EU881690| ... Put. C. cupressi |EU881689| ... Put. C. tujafilina |EU881686| ...T...T...C...T.AT....C..C...A...C... Put. C. tujafilina |EU881685| ...T...T...C...T.AT....C..C...A...C... C. tujafilina |EU881684| ...T...T...C...T.AT....C..C...A...C... C. tujafilina |EU881683| ...T...T...C...T.AT....C..C...A...C...
C. cupressi |EU881687| ATTaatAATggtACAggaACAggaTGAacaATTtacCCCcctCTAtccAACaatATTgctCATaatAATattTCAgtaGATttaACTattTTTtcaCTTc Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ...C... Put. C. cupressi |EU881692| ...C. Put. C. cupressi |EU881690| ... Put. C. cupressi |EU881689| ...C... Put. C. tujafilina |EU881686| ...C...CT....A...C... Put. C. tujafilina |EU881685| ...C...CT....A...C... C. tujafilina |EU881684| ...C...CT....A...C... C. tujafilina |EU881683| ...C...CT....A...C...
C. cupressi |EU881687| acCTAgcaGGAatcTCAtcaATCttaGGAgcaATTaatTTTattTGTacaATTttaAATataATAcctAATaatTTAaaaTTAaacCAAatcCCActtTT Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ... Put. C. cupressi |EU881692| ... Put. C. cupressi |EU881690| ...G... Put. C. cupressi |EU881689| ... Put. C. tujafilina |EU881686| ..T...C...A...T...T...C.. Put. C. tujafilina |EU881685| ..T...C...A...T...T...C.. C. tujafilina |EU881684| ..T...C...A...T...T...C.. C. tujafilina |EU881683| ..T...C...C...A...T...T...C..
C. cupressi |EU881687| CccaTGAtcaATTattATTacaGCTacaCTTttaATTcttTCActtCCAgtaTTAgccGGAgctATTacaATAttaTTAacaGATcgaAATttaAATacc Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ... Put. C. cupressi |EU881692| ... Put. C. cupressi |EU881690| ... Put. C. cupressi |EU881689| ... Put. C. tujafilina |EU881686| T...C..C...T Put. C. tujafilina |EU881685| T...C...T C. tujafilina |EU881684| T...C...T C. tujafilina |EU881683| T...C...T
C. cupressi |EU881687| TCAtttTTTgacCCAtcaGGAggaGGAgatCCAattTTAtatCAAcatTTAtttTGAtttTTTggtCACcctGAAgtgTATattTTAattCTAccaGGAt Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ... Put. C. cupressi |EU881692| ... Put. C. cupressi |EU881690| ... Put. C. cupressi |EU881689| ... Put. C. tujafilina |EU881686| ...C...C..A...T..C...T... Put. C. tujafilina |EU881685| ...C...C..A...T..C...T... C. tujafilina |EU881684| ...C...C..A...T..C...T... C. tujafilina |EU881683| ...C...C..A...T..C...T...
C. cupressi |EU881687| tcGGCctaATTtccCATattATTagaCAAgaaAGAaatAAAaatGAAactTTTggtAATattAGAataATTtatGCTataTTAacaATTggaTTActaGG Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ... Put. C. cupressi |EU881692| ... Put. C. cupressi |EU881690| ... Put. C. cupressi |EU881689| ... Put. C. tujafilina |EU881686| ....TT...T...C...C.C... Put. C. tujafilina |EU881685| ....TT...T...C...C.C... C. tujafilina |EU881684| ....TT...T...C...C.C... C. tujafilina |EU881683| ....TT...T...C...C.C...
C. cupressi |EU881687| AtttATTgtaTGAgctCATcatATAtttACAattGGAataGATgttGACacaCGAgcaTATtttACCtccGCAactATAattATTgctATCc Put. C. cupressi |EU881688| ... Put. C. cupressi |EU881691| ... Put. C. cupressi |EU881692| ... Put. C. cupressi |EU881690| ... Put. C. cupressi |EU881689| ... Put. C. tujafilina |EU881686| ...G..C..C..C...C...G...T...T...T. Put. C. tujafilina |EU881685| ...G..C..C..C...C...G...T...T...T. C. tujafilina |EU881684| ...G..C..C..C...C...G...T...T...T. C. tujafilina |EU881683| ...G..C..C..C...C...G...T...T...T.
Figura V-5: Alineamiento de haplotipos de secuencia única de CO-I para especies de Cinara depositadas en GenBank. Recuadros negros señalan los sitios de restricción para Hae III (GGCC). Tripletes alternados de letras mayúsculas y minúsculas en la secuencia superior indican el marco de lectura. Los puntos en el alineamiento corresponden a nucleótidos idénticos a la secuencia superior.
DNA extraído desde áfidos no identificados morfológicamente, provenientes de A. chilensis, fueron también amplificados, clonados y secuenciados. Las secuencias de 18 clones se separaron en dos grupos de 99% (3 clones) y 91% (15 clones) de identidad nucleotídica respecto de las secuencias de C. tujafilina reportada por Durak et al., (2008). El grupo de menor identidad presenta la misma secuencia nucleotídica que la obtenida para los áfidos colectados desde Cupressus sp. La secuencia de cada haplotipo único detectado pudo ser alineada y fácilmente clasificada como putativa C. tujafilina o C. cupressi. Cuarenta y cuatro sitios polimórficos fueron detectados entre ambas especies, encontrándose mínima diversidad nucleotídica intraespecífica para C. tujafilina, en tanto que todas las secuencias de C. cupressi fueron idénticas (Figura V-5 y Tabla V-1).
El haplotipo más frecuente de C. cupressi y C. tujafilina se encuentra presente también en las secuencias derivadas de los áfidos colectados desde A. chilensis (putativa C. cupressi y putativa C. tujafilina); sin embargo, entre estos clones se detecta mayor diversidad nucleotídica (Figura V-5 y Tabla V-1). La secuenciación de clones adicionales es necesaria para definir con precisión la frecuencia y distribución de los sitios polimórficos en cada especie y de acuerdo con los huéspedes, ya que los diferencias obtenidas podrían resultar del mayor número de clones secuenciados en A. chilensis.
El alineamiento de las secuencias de C. cupressi y C. tujafilina permitió determinar la existencia de diferencias en relación al sitio para la enzima de restricción Hae III. Se seleccionó la enzima Hae III, entre otras posibilidades, porque produce patrones de bandas para cada especie de áfido que pueden ser fácilmente diferenciados en gel de agarosa 2%. La ubicación del sitio de restricción en cada especie se indica en el Figura V-5. Perfiles de dos bandas se esperan para ambas especies, 530 pb y 220 pb para C. cupressi y 640 pb y 110 pb para C. tujafilina.
Preparaciones plasmídicas de clones provenientes de ambas especies, se cuantificaron, amplificaron y digirieron con Hae III, presentándose en la Figura V-6 los perfiles de bandas de 2 clones por especie, C. tujafilina (Líneas 1 y 2) y C. cupressi (Líneas 3 y 4). Los fragmentos en cada perfil tienen el tamaño esperado y ambas especies pueden ser fácilmente discriminadas de acuerdo con lo predicho. DNA extraído desde áfidos no identificados, colectados desde A. chilensis, fue también cuantificado, amplificado y clonado. Se digirieron 5 clones para evaluar la performance del método PCR-RFLP en desarrollo. Los perfiles resultantes se presentan en la Figura V-6 (Líneas 5, 6, 7, 8 y 9), 3 de ellos muestran el patrón de C. tujafilina (Líneas 5, 6 y 9), y 2 el patrón de C. cupressi (Líneas 7 y 8).
Thuja Cupressus Austrocedrus
Figura V-6: Perfiles de restricción de clones amplificados con primers COIS y COIA, digeridos con Hae III y separados por electroforesis en gel de agarosa 2% (TAE 1X). Clones de C. tujafilina recolectados desde Thuja sp.
(Líneas 1 y 2); clones de C. cupressi recolectados desde Cupressus sp. (Líneas 3 y 4) y clones desde áfidos
provenientes de A. chilensis (Líneas 5, 6, 7, 8 y 9). Marcador de peso molecular (Línea 10): pcDNAII digerido con
DdeI/XhoI (1140, 758, 540, 409 y 166 pb).
Extracciones de DNA provenientes de áfidos colectados de Thuja sp. y Cupressus sp. se amplificaron por PCR, siendo los fragmentos resultantes digeridos y separados por electroforesis sin previo clonado. Los perfiles obtenidos se corresponden con los esperados para C. tujafilina y C. cupressi (Figura V-7) indicando que el método de PCR-RFLP desarrollado puede ser empleado en forma directa sobre el material recolectado, sin requerir una etapa previa de clonado y selección de clones.
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Figura V-7:Amplicones obtenidos por PCR (Líneas 1 y 3) y perfiles de PCR-RFLP (Líneas 2 y 4) separados por electroforesis en gel de agarosa 2% (TAE 1X). Líneas 1 y 2, C. tujafilina recolectada desde Thuja sp.; Líneas 3 y 4,
C. cupressi recolectada desde Cupressus sp. Marcador de peso molecular (Línea 5): pcDNAII digerido con
3.3.- DISTRIBUCIÓN DE LAS ESPECIES C. CUPRESSI Y C. TUJAFILINA SEGÚN ESTADO