AMB CLSI 2,0-16,0 2,00 4,00 2,928 11 (55) 8 (40) 1 (5) 9 (45) 0 (0) 1 (5) 0 50 E-test 0,19-0,5 0,25 0,38 0,289 13 (65) 6 (30) 1 (5) ITZ CLSI 0,03-1,0 0,06 0,25 0,095 14 (70) 4 (20) 2 (10) 9 (45) 0 (0) 2 (10) 35 45 E-test 0,006-0,125 0,19 0,25 0,144 15 (75) 5 (25) 0 (0) KTZ CLSI 0,125-0,5 0,13 0,25 0,183 11 (55) 7 (35) 2 (10) 8 (40) 1 (5) 1 (5) 90 50 E-test 0,125-0,38 0,19 0,25 0,205 10 (50) 9 (45) 1 (5) VRZ CLSI 0,125-0,5 0,25 0,50 0,203 17 (85) 3 (15) 0 (0) 10 (50) 0 (0) 0 (0) 90 50 E-test 0,094-0,38 0,13 0,25 0,155 10 (50) 9 (45) 1 (5) M. furfur
Antifúngico Método Rango CIM50 CIM90 MG
Aislamientos (%) Discrepancia (%)
AE (%) AC (%) S I R Menor Mayor Muy mayor
AMB CLSI 4,0-16,0 16,00 16,00 12,553 0 (0) 6 (30) 14 (70) 14 (70) 0 (0) 4 (20) 10 10 E-test 0,5-32,0 2,00 6,00 2,558 10 (50) 8 (40) 2 (10) ITZ CLSI 0,03-0,5 0,13 0,13 0,112 18 (90) 0 (0) 2 (10) 0 (0) 2 (10) 2 (10) 60 80 E-test 0,047-0,5 0,25 0,25 0,201 18 (90) 0 (0) 2 (10) KTZ CLSI 0,06-0,5 0,25 0,50 0,217 14 (70) 6 (30) 0 (0) 5 (25) 0 (0) 0 (0) 85 75 E-test 0,064-0,38 0,25 0,38 0,221 16 (80) 4 (20) 0 (0) VRZ CLSI 0,06-8,0 0,25 0,50 0,287 11 (55) 8 (40) 1 (5) 6 (30) 0 (0) 0 (0) 65 70 E-test 0,008-2,0 0,13 0,38 0,135 12 (60) 6 (30) 2 (10)
AMB (anfotericina B), ITZ (itraconazol), KTZ (ketoconazol), VRZ (voriconazol), MG (media geométrica), AE (acuerdo esencial), S (susceptible), I (susceptible intermedio), R (resistente), AE (acuerdo esencial), AC (acuerdo categórico)
74
Se debe recordar que anfotericina B pertenece al grupo de antifúngicos poliénicos, cuya actividad antimicótica está relacionada con su capacidad para unirse a los esteroles de la membrana celular, lo que conduce a la pérdida de importantes componentes intracelulares. Es de amplio espectro de actividad, destruyendo una gran variedad de hongos patógenos (efecto fungicida), pero con una gran toxicidad, específicamente a nivel renal con su administración sistémica, de diferente gravedad según la dosis y duración del tratamiento (Isaza et al. 2002). Sin embargo, se ha documentado respuesta variable de levaduras del género Malassezia a anfotericina B, ya que el estudio realizado por Velegraki
et al. (2004) reporta valores altos de CIM, mientras que el estudio publicado por Álvarez et al. (2014) reporta que los aislamientos de M. pachydermatis evaluados fueron
susceptibles a anfotericina B a CIM ≤ 1 ug/ml. Los resultados del presente estudio concuerdan con los encontrados por Velegraki et al. 2014, pues fue anfotericina B el compuesto que mostró una menor actividad antifúngica y mayor porcentaje de aislamientos resistentes especialmente por la técnica de microdilución en caldo y para aislamientos de M. furfur (origen humano). Aunque no han sido estudiados los mecanismos de resistencia en Malassezia spp., en otras levaduras de importancia médica como Candida spp. y Cryptococcus spp. se han descrito cepas mutantes que expresan enzimas responsables de una menor concentración de ergosterol en la membrana celular que pueden causar resistencia a anfotericina B, al igual que bombas de eflujo a múltiples drogas que pueden determinar resistencia cruzada a anfotericina B y fluconazol (Cannon et al. 2009).
Los imidazoles (ketoconazol) y triazoles (itraconazol y voriconazol) son antifúngicos cuyo mecanismo de acción consiste en la inhibición de la biosíntesis del ergosterol por bloqueo de la desmetilación del 14-α-esterol dependiente del citocromo P-450, lo que altera la composición y permeabilidad de la membrana celular, al igual que inhiben la síntesis de triglicéridos y fosfolípidos y la actividad oxidativa y peroxidativa de las enzimas, conduciendo a una acumulación tóxica de peróxido de hidrógeno. Su actividad es fungistática en concentraciones bajas o fungicida en altas concentraciones frente a un
75
amplio espectro de hongos dependiendo de la especie, y en general la toxicidad para el hospedero es menor comparada con la de los polienos, dada por hepatotoxicidad ocasional. Los triazoles presentan aún menor toxicidad y mayor espectro antimicótico (Isaza et al. 2002). En Malassezia spp. se han observado cambios en la estructura celular y
en la tasa de crecimiento ante la presencia de compuestos azólicos. Itraconazol tiene efecto fungicida porque interfiere con la síntesis de quitina e in vitro es más activo que
ketoconazol (Jain & Sehgal 2001, Arenas 2008), lo cual podría explicar por qué itraconazol resultó ser el compuesto con mejor actividad antifúngica frente a levaduras del género
Malassezia en este trabajo, frente a todos los aislamientos evaluados
independientemente del origen y la especie, resultados similares a los encontrados por otros investigadores que han evaluado perfil de susceptibilidad en Malassezia spp.
(Nakamura et al. 2000, Cafarchia et al. 2012).
Dado que en la práctica clínica se utiliza empíricamente ketoconazol o itraconazol para el tratamiento de infecciones cutáneas por levaduras del género Malassezia tanto en humanos como en caninos (Matousek et al. 2003, Sarierler & Kirkan 2004, Petrov & Mihaylov 2008, Hu & Bigby 2010, Boekhout et al. 2010), a partir de los resultados obtenidos en este estudio se recomienda utilizar itraconazol tópico o vía oral para infecciones cutáneas por M. furfur en humanos y M. pachydermatis en caninos, dependiendo de la extensión y severidad del cuadro clínico. Para infecciones sistémicas por M. furfur en humanos se ha utilizado en la práctica clínica triazoles intravenosos o anfotericina B de forma empírica (Tragiannidis et al. 2009, Boekhout et al. 2010); sin embargo, a partir de los resultados obtenidos no se recomienda utilizar anfotericina B y en su lugar se recomienda itraconazol o voriconazol intravenosos, pues a pesar de que los aislamientos del presente estudio provenían de patologías cutáneas, son las cepas presentes en la piel las que producen infecciones diseminadas en pacientes inmunocomprometidos.
76
Para determinar el grado de concordancia entre las dos técnicas utilizadas en la evaluación del perfil de susceptibilidad in vitro de levaduras del género Malassezia
también se abordaron varias aproximaciones estadísticas que se encuentran resumidas en la tabla 14 y el anexo 2, en los cuales se puede observar que voriconazol es el antifúngico que presentó una mayor concordancia entre las dos técnicas, desde la categorización interpretativa de las variables y los valores de CIMs propiamente dichas, con resultados estadísticamente significativos para M. furfur. A pesar de observar concordancia de las
dos técnicas frente a voriconazol y los reportes de algunos autores que recomiendan el uso de E-test en lugar de microdilución argumentando que la técnica de E-test es una metodología menos laboriosa y más fácil de implementar en los laboratorios de microbiología (Cafarchia et al. 2012), los diferentes análisis realizados frente a todos los antifúngicos evaluados no muestran el mismo comportamiento. Por esta razón es importante seguir evaluando el perfil de susceptibilidad in vitro de levaduras del género Malassezia con tamaños de muestra más grandes, mayor variabilidad de especies y determinando la reproducibilidad de las condiciones de cultivo utilizadas.
77 7. CONCLUSIONES
• Todos los aislamientos de origen canino fueron identificados como M. pachydermatis
y los de origen humano como M. furfur, por las herramientas moleculares PCR-RFLP y
secuenciación de las regiones 5.8S y 26S ADNr.
• PCR-RFLP es una técnica que permite identificar a nivel molecular levaduras del género
Malassezia utilizando las tres enzimas evaluadas (AluI para la región 5.8S ADNr y CfoI y BstF5I para la región 26S ADNr) al obtener patrones de restricción distintivos para
cada especie.
• Las regiones 5.8S y 26S ADNr son marcadores genéticos que permiten identificar adecuadamente a nivel de especie levaduras del género Malassezia mediante secuenciación y comparación en la base de datos del GenBank y/o colecciones de hongos.
• La región 5.8S ADNr provee una mejor resolución filogenética del género Malassezia
que la región 26S ADNr para la identificación molecular a nivel de especie ya que la topología de los árboles muestra mayores valores de soporte bootstrap y corresponde mejor con los patrones de restricción obtenidos con PCR-RFLP.
• Las técnicas moleculares permitieron identificar a nivel de especie el 100% de los aislamientos de Malassezia spp.,mientras que las pruebas fenotípicas convencionales no son concluyentes para identificación a nivel de especie.
• Las técnicas moleculares permiten caracterizar polimorfismos o variabilidad genética intraespecífica como lo observado con la enzima de restricción BstF5I para M. pachydermatis, lo cual es importante desde el punto de vista epidemiológico y ecológico.
78
• Las condiciones de cultivo utilizadas en el presente estudio para determinar la susceptibilidad in vitro de levaduras del género Malassezia permitieron establecer las CIM a las 72 horas de incubación tanto por microdilución en caldo como por E-test.
• La lectura visual en la técnica de microdilución en caldo resultó ser más precisa para determinar las CIMs de los antifúngicos frente a Malassezia spp. que la lectura espectrofotométrica.
• Itraconazol fue el compuesto con mayor actividad antifúngica frente a Malassezia spp. independientemente del origen y la especie.
• Anfotericina B fue el compuesto con menor actividad antifúngica frente a Malassezia
spp., principalmente para M. furfur.
• La concordancia entre las dos técnicas utilizadas fue estadísticamente significativa para voriconazol frente a M. furfur. Sin embargo, los diferentes análisis realizados no mostraron el mismo comportamiento frente a todos los antifúngicos evaluados.
79 8. RECOMENDACIONES
• Utilizar PCR-RFLP o secuenciación de las regiones 5.8S y 26S ADNr como herramientas moleculares para identificar a nivel de especie levaduras del género Malassezia.
• Determinar el perfil de susceptibilidad de levaduras del género Malassezia spp. frente
a los antifúngicos de uso clínico, principalmente en aislamientos sistémicos de origen humano con el objetivo de proveer al paciente un tratamiento dirigido, al igual que disminuir la toxicidad y posible selección de cepas resistentes propias del tratamiento empírico.
• Evaluar la reproducibilidad de las condiciones de cultivo utilizadas en el presente estudio (emulsionante para preparación del inóculo, medio de cultivo y lectura visual a las 72 horas de incubación) con un tamaño de muestra más grande, mayor variabilidad de especies, montajes en tiempo y número de observadores.
• Realizar más estudios colaborativos que evalúen el perfil de susceptibilidad in vitro de levaduras del género Malassezia, con el fin de determinar las condiciones de cultivo óptimas y los puntos de corte que definan sensibilidad o resistencia a los antifúngicos y de esta forma poder hacer conclusiones de mayor valor para el manejo clínico de las infecciones relacionadas con este microorganismo.
• Llevar a cabo más estudios que comparen la técnica de referencia para la evaluación de la susceptibilidad de levaduras (microdilución en caldo) y otras técnicas alternativas, como E-test, que sean menos laboriosas y más fáciles de implementar en los laboratorios de microbiología.
• Es necesario la implementación de cepas control del género Malassezia para una validación adecuada de las pruebas de susceptibilidad in vitro.
80
• Se recomienda la ejecución de estudios encaminados a dilucidar los posibles mecanismos de resistencia que tengan las levaduras del género Malassezia frente a los antifúngicos de uso clínico.
• Diseñar estudios para determinar el potencial de transmisión zoonótica que tendrían las levaduras del género Malassezia.
81 9. BIBLIOGRAFÍA
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