La evaluación de necrosis al interior de los haces vasculares en la primera repetición en el tiempo evidenció diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p=0,010), aunque la prueba de Tukey solo mostró una agrupación en donde se encontraron todos los aislamientos. Esta agrupación fue diferenciada mediante el análisis de los tratamientos con la prueba de Duncan, donde se generaron cuatro agrupaciones, sin embargo, se encontraron sobrelapamientos entre los grupos y los únicos aislamientos que presentaron diferencias con los controles (abiótico y negativo) fueron el 161 y el 314 (anexo 7.2.1). El aislamiento 161 fue el que generó mayor necrosis con un promedio de 0,93mm, seguido por el aislamiento 314 que generó 0,8mm, mientras que los aislamientos 319 y 409 no generaron el síntoma (figura 7.2).
Para la evaluación del avance del patógeno se pudo evidenciar que todos los aislamientos fueron re-aislados del hospedero, encontrando diferencias significativas entre los mismos (p=2,8x10-10). En este caso, el aislamiento 310 empleado como control positivo fue el que se re-aisló en mayor proporción, con un avance de 1,8cm mientras que el aislamiento 314 fue el que tuvo menor avance (0,5cm) (figura 7.2). La prueba de Tukey permitió la diferenciación de tres grupos los cuales no estuvieron definidos ni por especie ni por origen de aislamiento (anexo 7.2.1).
83 Figura 7.2: Resultados de evaluación de longitud de necrosis y avance del patógeno en tomate,
primera repetición en el tiempo. CA: control abiótico; CN: control negativo; 310: control positivo; serie 100: animales; serie 200: humano superficial; serie 300: plantas; serie 400: humano
sistémico. Tukey α-0,05.
La evaluación de los mismos parámetros en la segunda repetición en el tiempo indicó que los resultados fueron diferentes con respecto a los obtenidos en la primera. Para la longitud de necrosis se pudieron encontrar diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p=0,045) donde nuevamente el aislamiento 161 (F. verticillioides) de origen animal fue el que
generó el síntoma en mayor proporción (1,13mm), mientras que con el aislamiento 314 (F. oxysporum) de origen vegetal no se evidenció el síntoma. En este caso los
valores de necrosis fueron superiores a los obtenidos en la primera repetición para los aislamientos 161, 203, 205, 310, 319, 404, 406 y 409, mientras que para los demás aislamientos la necrosis se vio disminuida (figura 7.3). Las agrupaciones de Tukey mostraron que nuevamente el aislamiento 161 fue el único que presentó diferencias estadísticamente significativas con los controles abióticos y negativo. De igual manera, en el avance del patógeno también se vieron diferencias con respecto a la primera repetición. Todos los hongos se recuperaron en mayor proporción en la segunda repetición, a excepción del aislamiento 404 que tuvo el menor avance (0,8cm); por otra parte, el aislamiento 319 de plantas fue el que tuvo el mayor avance con 2,9cm (figura 7.3). Las agrupaciones de Tukey se
84 caracterizaron porque todas incluyeron al menos un aislamiento de cada uno de los orígenes (anexo 7.2.2).
Figura 7.3: Resultados de evaluación de longitud de necrosis y avance del patógeno en tomate, segunda repetición en el tiempo. CA: control abiótico; CN: control negativo; 310: control positivo;
serie 100: animales; serie 200: humano superficial; serie 300: plantas; serie 400: humano
sistémico. Tukey α-0,05.
La necrosis u oscurecimiento de los haces vasculares es un síntoma que se reporta con frecuencia en las infecciones causadas por Fusarium en tomate,
especialmente para las especies de F. oxysporum y F. solani, y se ha descrito que
en estadios avanzados de desarrollo de la planta, este síntoma puede llegar a alcanzar hasta 50cm de longitud (Tello y Lacasa 1988). Para el caso del presente estudio se pudo confirmar que todos los aislamientos generaron necrosis al interior de los haces vasculares y a pesar de que los valores no fueron superiores a un milímetro, es importante resaltar que especies como F. verticilliodes y F. sporotrichioides, que no son reportadas como agentes causales de
marchitamiento vascular en tomate, tuvieron la capacidad de inducir el síntoma. Adicionalmente, esto no estuvo condicionado al origen de aislamiento, ya que todos los hongos generaron necrosis en alguna o en las dos repeticiones en el tiempo, siendo los aislamientos 162 (animal), 203 y 205 (humano superficial) los que tuvieron valores constantes en las dos repeticiones. Esto concuerda con lo
85 reportado por Ignjatov et al. (2012) quienes encontraron en cultivos de tomate la
presencia de este patógeno, evidenciada en síntomas dentro de los cuales se incluía la coloración café típica de los haces vasculares en tallo. Adicionalmente, Momol et al. (2004) indican que esta necrosis puede estar presente desde las
raíces y se extiende hacia el tallo, lo cual fue confirmado en el presente estudio. Por otra parte, es importante resaltar que se confirmó la infección de los aislamientos de Fusarium en las plantas de tomate gracias a los resultados
obtenidos para el avance del patógeno, donde al realizar el re-aislamiento se encontró que todos los hongos se establecieron en su hospedero, y aunque no se evidenció el marchitamiento vascular, la necrosis y avance en haces vasculares indican un inicio del proceso infectivo, donde se integran la capacidad del patógeno para adherirse, penetrar y comenzar la invasión del tejido vegetal.
La importancia sobre la colonización de este patógeno ha sido confirmada por autores como Lagopodi et al. (2002) quienes al realizar microscopia confocal para
semillas de tomate susceptibles a la infección por F. oxysporum f.sp. radicis- lycopersici, encontraron que el inicio de la infección comenzaba con el contacto
del patógeno con los pelos radicales, seguido por la adhesión y penetración de las raíces y células de la epidermis y finalmente la colonización del tejido radical. Según los autores, esta colonización es clave en la aparición de síntomas como la necrosis y la coloración café de las raíces infectadas. Así mismo, Pshibytko et al.
(2006) estudiaron los cambios en el aparato fotosintético de plantas de tomate de seis meses de desarrollo infectadas por inmersión de la raíz con 5x107 conidios/mL de F. oxysporum. Estos autores reportan la aparición de dos patrones
de la enfermedad relacionadas con las condiciones ambientales: una enfermedad lenta (20-30 días de duración) dada a temperaturas de 18-22°C y humedad de 50- 60%, y una enfermedad rápida (7-10 días) en temperaturas mayores a 25°C y humedades del 65 al 85%. Lo que es importante resaltar de este estudio es que el proceso de colonización del patógeno y los efectos generados por el mismo para cada enfermedad fueron diferentes. Para la enfermedad lenta se encontró que los microconidios del patógeno y su micelio se encontraban colonizando parcialmente
86 el xilema y gran parte de las células del parénquima que contienen los productos de reserva, por lo que las plantas morían por déficit nutricional y por posible producción de metabolitos del hongo como las micotoxinas, mientras que en la enfermedad rápida los propágulos y el micelio se encontraban colonizando xilema y floema, lo que generaba una muerte de la planta por interrupción del flujo de agua y nutrientes. Adicionalmente, encontraron que con la enfermedad lenta se manifestaban síntomas como amarillamiento, lo cual generó una disminución de la clorofila afectando así el aparato fotosintético y la actividad de la enzima rubisco, mientras que en la enfermedad rápida no se presentaron síntomas y se generó un aumento de pigmentos carotenoides así como el cierre estomático debido a la deshidratación, además de la generación de otras estrategias para disipar la energía lumínica y evitar el daño del aparato fotosintético.
Los resultados reportados por Pshibytko et al. (2006) son muy importantes ya que
indican la importancia del proceso de colonización de los diferentes órganos vegetales, lo cual puede ser determinante para el tipo de manifestación de la enfermedad generada por Fusarium. Con el presente estudio se pudo hacer un re-
aislamiento del patógeno al interior de los haces vasculares, por lo que se puede confirmar que los factores de patogenicidad como las enzimas líticas evaluadas en el capítulo anterior, pudieron estar presentes en la degradación del tejido vegetal y, posiblemente, un tiempo mayor de evaluación de la patogenicidad en condiciones óptimas y en diferentes estadios de desarrollo vegetal habría permitido la observación de fenómenos como el descrito anteriormente.