Comparison of Partner-Prediction Performance using RPIMs versus Con-

Los resultados obtenidos en los experimentos realizados con lovastatina y los inhibidores de las preniltransferasas, sugerían la participación de distintos miembros de la superfamilia Ras en varias etapas del ciclo replicativo del VPPA, incluyendo el paso de la entrada del virus, que se había visto afectado por la acción del inhibidor de la geranilgeranilación. Entre los miembros de esta superfamilia, los primeros candidatos a participar en la entrada del virus podrían ser los miembros de la familia Rho, ya que muchos de ellos incorporan un grupo geranilgeranilo, esencial para su actividad. El hecho de que estas GTPasas gobiernen el citoesqueleto y el tráfico de vesículas (Qualmann y Mellor, 2003; Gundersen, et al., 2004; Watanabe, et al., 2005; Bustelo, et

al., 2007), las convertía en serias candidatas a participar en la entrada del VPPA, el cual,

como ya se ha comentado anteriormente, entra en las células a través de una endocitosis mediada por receptor y utiliza los microtúbulos para transportarse por la célula hasta llegar a las proximidades del núcleo (Carvalho, et al., 1988; de Matos y Carvalho, 1993; Alonso, et al., 2001).

2.1. Efecto de la inhibición de las GTPasas Rho en la producción de virus

Con el fin de examinar la validez de esta hipótesis, se interfirió la actividad de esta familia de proteínas en el transcurso de la infección. Para ello se recurrió a la acción inhibidora de la toxina B de Clostridium difficile. Esta toxina es capaz de inhibir a los miembros más conocidos de la familia Rho: RhoA, Rac1 y Cdc42. A la GTPasa RhoA la inactiva glucosilando a la treonina de la posición 37, y a las proteínas Rac1 y dc42 en la posición correspondiente (Just, et al., 1995). Esta glucosilación impide a ualquiera de dichas GTPasas interaccionar con sus efectores.

C c

La presencia de este inhibidor de las GTPasas Rho produjo en las células Vero la retracción, el redondeo y el aspecto arborizado descritos en la bibliografía (Fiorentini, et al., 1989; Malorni, et al., 1990), aunque a unas concentraciones de toxina bastante más elevadas (25 ng/ml frente a los 0,15 ng/ml descritos en Malorni y colaboradores). Al igual que con las drogas anteriores, se evaluó la viabilidad celular en presencia de este inhibidor a distintas concentraciones (Figura 14), en las que no resultó ser tóxico para las células Vero.

En la figura 15A puede apreciarse como la inhibición de las GTPasas Rho, en un cultivo de células infectadas, provoca una reducción cercana al 50% en los títulos virales obtenidos. Se puede observar también como esta reducción es similar en todas las concentraciones ensayadas del inhibidor, sin darse un efecto dependiente de la dosis. Al incubar las células con este inhibidor a distintos tiempos del ciclo infectivo (la misma estrategia utilizada que con los inhibidores FTI-277 y GGTI-286), se descubrió que la reducción del título viral se produce al añadir la droga antes de la adsorción del virus (Figura 15B).

Este result

Figura 14. Estudio de la viabilidad celular en presencia del inhibidor de las GTPasas Rho. Las

células fueron incubadas durante 24h con el inhibidor de las GTPasas Rho antes de ser contabilizadas con la tinción vital azul de Tripán. Los datos mostrados representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.

ado apunta a que la participación de las GTPasas Rho durante la ntrada del virus es necesaria para el éxito de la infección.

2.2. Implic

2hpi), coincidiendo con e

ación de las GTPasas Rho en la acetilación de los microtúbulos durante la entrada del VPPA

Las GTPasas de la familia Rho podrían participar en la entrada del VPPA modulando la estabilidad de los microtúbulos (Best, et al., 1996; Cook, et al., 1998; Daub, et al., 2001; Palazzo, et al., 2001; Fukata, et al., 2002), que el virus explota para llegar hasta la región perinuclear (Alonso, et al., 2001). El VPPA estabiliza los microtúbulos durante los tiempos tardíos de la infección (1

Figura 15. Producción de virus en presencia del inhibidor de las GTPasas Rho. (A) Las células

fueron incubadas con el inhibidor de las GTPasas Rho desde 2-4h antes de la infección. Tras la adsorción se lavaron las células y se añadió medio fresco con inhibidor. (B) El inhibidor de las GTPasas Rho fue añadido en distintos momentos del ciclo infectivo, reduciendo los títulos de virus al añadirse antes de la adsorción. Los datos mostrados representan la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes.

el momento en el que las nuevas partículas de virus formadas comienzan a migrar a la periferia de la célula (Jouvenet, et al., 2004). De la misma manera, el VPPA debería estabilizar los microtúbulos al entrar en las células que infecta, al utilizarlos para transportars

entrada del VPPA induce la estabilización de los microtúbulos, detectándos

Figura 16C). Con el fin de omprobar si este aumento en la acetilación de la α-tubulina era debido a la actividad de

cogidas a los 30mpi, que era el tiempo en el que se había detectado e

e por el citoplasma de la célula.

Para comprobar esta posibilidad, se analizó por WB la cantidad de α- tubulina acetilada a distintos tiempos durante las 3 primeras horas de la infección (Figura 16A). Las bandas obtenidas en el WB fueron densitometradas para obtener unos valores semicuantitativos y poder evaluar el grado de acetilación de la α-tubulina. Los valores de α-tubulina acetilada fueron relativizados con los valores obtenidos de α- tubulina total, determinados también por WB y densitometría. Los resultados obtenidos confirmaron que la

e un pico de máxima acetilación (aumento de 4 veces de la cantidad de α- tubulina acetilada) a los 30 minutos post-infección (mpi;

c

las GTPasas Rho, se procedió a su inhibición y posterior infección de las células. Todas las muestras fueron re

l máximo nivel de acetilación de la α-tubulina. Como se puede apreciar en la figura 16, paneles B y D, la inhibición de las GTPasas Rho impidió el aumento de los niveles de α-tubulina acetilada, hallándose incluso por debajo de los niveles basales.

Este resultado sugiere que las GTPasas Rho deben activarse durante la entrada del VPPA y que esta activación deriva en un incremento de la cantidad de α- tubulina acetilada presente en la célula infectada.

B