Structure-based Methods

El ciclo infectivo del VPPA tiene una duración de unas 18-24 horas (Costa, 1990) y empezaría, como en todos los virus, con la unión de una partícula de virus a una célula diana. Esta unión a la célula se daría por la unión a uno o varios receptores

presentes en la membrana plasmática (Galindo, et al., 1997). En macrófagos, el marcador de superficie CD163 podría determinar qué subpoblaciones celulares serían susceptibles de ser infectadas por el virus (McCullough, et al., 1999; Sánchez-Torres, et

al., 2003). Estudios de microscopía electrónica y con drogas que afectan al pH de los

lisosomas, apuntan a que la entrada del VPPA sería por endocitosis mediada por

receptor, sin que hiciera falta la participación de elementos del citoesqueleto. El core del virus sería liberado en el citoplasma tras la fusión de la envuelta del virus y la

membrana del endosoma. Este proceso es dependiente de pH y de la presencia de colesterol en la membrana del endosoma (Geraldes y Valdeira, 1985; Valdeira y

Geraldes, 1985; Alcamí, et al., 1989; Bernardes, et al., 1998; Valdeira, et al., 1998). Se desconoce el tipo de vesícula endocítica a través de la cual entraría el VPPA, aunque existen indicios de que podría ser a través de vesículas recubiertas de clatrina (Valdeira y Geraldes, 1985; Alcamí, et al., 1989). La entrada por caveolas podría descartarse debido al tamaño del virión (Chung, et al., 2005). Las proteínas del virus p12 (ORF O61R), p72 y p54 parecen estar implicadas en la unión del virus a las células, mientras que la p30 (ORF CP204L) estaría implicada en la internalización del virus (Alcamí, et

al., 1992; Angulo, et al., 1993; Borca, et al., 1994; Gómez-Puertas, et al., 1998). Una

vez que el virus ha entrado en la célula, se dirige a la región perinuclear para comenzar su replicación. Para ello el virus utiliza el transporte microtubular mediado por la dineína (Alonso, et al., 2001).

Figura 7. Morfología del virión del VPPA. A-D) Distintas etapas de la morfogénesis de los viriones,

desde el plegamiento de las membranas del RE para dar la forma icosaédrica característica (A y B), hasta las formas más maduras con la condensación del material genético y la consiguiente aparición del nucleoide (C y D). E) Representación esquemática de la partícula viral.

A B C D Membrana interna Nucleoide Cubierta de proteínas Cápsida Envuelta externa E 200 nm

6.4.2. Transcripción y replicación del genoma

La transcripción de los genes tempranos empieza en el citoplasma tras la desencapsidación del virus, y no requiere la ARN polimerasa II celular (Salas, J., et al., 1988), ya que el VPPA codifica la suya propia (Yáñez, et al., 1993a). La transcripción temprana está fuertemente regulada en el tiempo y los ARNm son similares a los eucarióticos, presentando modificaciones como la poliadenilación en el extremo 3’ (Almazán, et al., 1992; Almazán, et al., 1993; Rodríguez, J. M., et al., 1996).

La expresión de los genes tempranos termina cuando se inicia la replicación del genoma viral. En un primer paso, el genoma del VPPA entra en el núcleo, posiblemente por la acción de la proteína p37 (Eulalio, et al., 2004; Eulalio, et al., 2007), donde empieza la síntesis de fragmentos de ADN subgenómicos. Estos fragmentos de ADN se trasladan al citoplasma, donde se continúa y completa su síntesis (García-Beato, et al., 1992b; Rojo, et al., 1999). La replicación del genoma del VPPA es similar a la descrita para los poxvirus (Moss, 2001), salvo que en los poxvirus no es necesario el paso por el núcleo. En el caso del VPPA, el paso del genoma por el núcleo celular podría ser debido a la necesidad de la actividad primasa de las subunidades de la ADN polimerasa celular α, de la que el virus parece carecer (Yáñez, et al., 1995; Rojo,

et al., 1999).

6.4.3. Ensamblaje y morfogénesis de los viriones

La replicación del genoma en el citoplasma se da en la región perinuclear cercana al MTOC (Heath, et al., 2001), en lo que se denomina factoría viral. En las factorías virales se acumulan también las proteínas estructurales que formarán parte de los nuevos viriones, junto con los genomas generados y las membranas procedentes del RE (Cobbold, et al., 1996; Andrés, et al., 1998). En la formación de las factorías participan distintos elementos del citoesqueleto. Los microtúbulos son necesarios para la formación de las factorías, y junto con ellos la dineína (Carvalho, et al., 1988; Alonso, et al., 2001). Las factorías son englobadas en un acúmulo de filamentos intermedios (vimentina), que recuerda a la formación de los agresomas (Carvalho, et al., 1988; Johnston, et al., 1998; García-Mata, et al., 1999; Heath, et al., 2001). La reagrupación de la vimentina alrededor de las factorías también es dependiente de los microtúbulos (Stefanovic, et al., 2005).

La proteína p54 del virus es insertada en las membranas del RE y en consecuencia queda integrada en la membrana que rodea el nucleoide del virión (Rodríguez, F., et al., 1996; Rodríguez, J. M., et al., 2004). Se ha descrito la interacción de p54 con la cadena ligera de 8 kDa de la dineína (DLC8; Alonso, et al., 2001). Esta interacción podría permitir el reclutamiento de las membranas del RE en las factorías

virales, y también el transporte de los viriones desde la membrana plasmática hasta las proximidades del núcleo.

Todos los procesos que se dan en las factorías requieren mucha energía, y esta es aportada por las mitocondrias, que son reagrupadas por medio de los microtúbulos alrededor de la factoría viral (Rojo, et al., 1998; Hernáez, et al., 2006).

6.4.4. Salida de los viriones

Una vez que los viriones han sido formados y completado su maduración, son transportados hasta la periferia de la célula utilizando el transporte microtubular mediado por el motor de la kinesina (de Matos y Carvalho, 1993; Jouvenet, et al., 2004). La proteína codificada por el gen E120R es esencial para el transporte de los viriones hasta la periferia celular, puesto que en su ausencia los viriones quedan retenidos en la factoría viral (Andrés, et al., 2001b). Una vez que los viriones alcanzan la membrana plasmática son capaces de estimular la polimerización de actina, produciendo prolongaciones tipo filopodio con una partícula vírica en el extremo de dicha prolongación (Jouvenet, et al., 2006). A diferencia de lo que sucede con las prolongaciones generadas por el VV (Cudmore, et al., 1995; Rietdorf, et al., 2001), no se ha demostrado que el VPPA pueda infectar a las células vecinas por medio de estas proyecciones.