Computational complexity

La diferenciación megacariocítica puede ser inducida por ésteres de forbol (PMA), agentes promotores de tumores. La diferenciación megacarioblástica de la línea celular MEG-01 conlleva un aumento de expresión en superficie del complejo GPIIb/IIIa, un aumento en la capacidad de adherencia e inhibición de la proliferación celular (Ogura et al, 1988). El aumento de expresión de GPIIb/IIIa inducido por PMA es dosis-dependiente, por ello, comenzamos estudiando qué concentraciones de PMA y durante qué período de tiempo se han de tratar las células para conseguir una diferenciación significativa sin que se vea demasiado afectada la viabilidad celular.

Células MEG-01, creciendo exponencialmente a una concentración de 2x105_{/ml en}

medio RPMI-1640 con un 10% de suero, fueron incubadas con concentraciones entre 0,5 y 150 nM de PMA durante 4 días. Pasado este tiempo, se recogieron las células en suspensión y las adheridas al plato se despegaron mediante tratamiento con 0,5 mM EDTA. Se observó que el PMA provocaba una disminución del crecimiento celular y un aumento de la capacidad de adherencia. En las células recogidas al cuarto día se determinó el grado de diferenciación midiendo por citometría de flujo la expresión de GPIIb y GPIIIa. Las células MEG-01 sin tratar con PMA expresan cantidades detectables de complejo GPIIb/IIIa pero, como indica la figura 47 A, el tratamiento con concentraciones crecientes de PMA aumentó la expresión de GPIIb/IIIa, alcanzando un valor máximo con una concentración de 60 nM. Para determinar la viabilidad celular tras el tratamiento con PMA, las células fueron tratadas con yoduro de propidio (50 µg/ml) y analizadas por citometría de flujo. Concentraciones de PMA por encima de 30 nM, redujeron la viabilidad celular por debajo del 50% a juzgar por el número de células que captaron el yoduro de propidio.

Para determinar el efecto del tiempo de exposición a PMA sobre la diferenciación, las células se trataron con 0,5, 2,5, 5 y 10 nM PMA y se analizaron al cabo de 1 o 4 días de tratamiento. En las células tratadas durante 1 día se observó una diferenciación menor que en las expuestas 4 días a la misma concentración de PMA (Figura 47 B). Estos datos parecen indicar que la diferenciación megacariocítica

Resultados

Figura 47

DIFERENCIACIÓN MEGACARIOCÍTICA DE CÉLULAS MEG-01 INDUCIDA POR PMA

0 1 2 3 4 5 In cremen to d e exp resió n en su p e rficie

(cociente del canal medio de fluorescencia)

0 0,5 2,5 5 10 15 30 60 100 150 PMA(nM) GPIIb GPIIIa

A

(canal medio de fluoerescencia)

0 2,5 5 7,5 10 12,5

PMA(nM)

4días 1día

B

(A) Células MEG-01 son tratadas con concentraciones entre 0.5 y 150 nM de PMA durante 4 días. La expresión en superficie de GPIIb y GPIIIa se mide por citometría de flujo con anticuerpos específicos, como se describe en la sección de Métodos. Los resultados se representan como el cociente del canal medio de fluorescencia (unidad arbitraria a escala lineal) de células tratadas entre el de células sin tratar, en función de la dosis de PMA administrada en cada caso. (B) Células MEG-01 tratadas con 0.5, 2.5, 5 y 10nM de PMA se analizan al cabo de 1 o 4 días de tratamiento. El grado de diferenciación fue valorado determinando la expresión en superficie del complejo GPIIb/IIIa mediante citometría de flujo. En esta gráfica se recogen los valores de fluorescencia obtenidos con anti-GPIIIa al cabo de 1 o 4 días para cada uno de los tratamientos con PMA.

Resultados

(expresión de GPIIb/IIIa) requiere un tiempo superior a 24 horas para que sea apreciable por los métodos analíticos utilizados.

En base a los datos expuestos, optamos por tratar las células con 1, 10 y 40 nM PMA durante 4 horas, o 1 hora en el último caso, e incubarlas durante tres días sin PMA antes de analizar por citometría de flujo el contenido de GPIIb/IIIa. La viabilidad con 1 y 10 nM de PMA no se vio afectada y con 10 nM PMA el aumento de expresión de GPIIb y GPIIIa fue suficientemente significativo como para poder estudiar qué tipo de correlación existe entre la expresión superficial de GPIIb y/o GPIIIa y los niveles de RNA mensajero. Para ello, se extrajo RNA total de células MEG-01 sin tratar o tratadas con 10 nM PMA. Se cuantificó el RNAm de GPIIb y GPIIIa por RT-PCR con sondas TaqMan específicas, normalizándose los resultados con los valores obtenidos para β-Actina. Calculando los cocientes de los valores obtenidos para células tratadas con PMA frente a células control, se observa que existe una correlación entre el incremento de GPIIb y GPIIIa en superficie, medido por citometría de flujo, y el incremento de RNAm, medido por RT-PCR cuantitativo (Figura 48). El incremento de RNAm de GPIIb y su expresión en superficie al tratar las células MEG-01 con 10 nM de PMA es sólo de 0,5 veces, mientras que el incremento observado para GPIIIa en ambos casos es mucho mayor, aproximadamente 2-2,5 veces. Para confirmar los datos anteriores, analizamos mediante transferencia de western los lisados de células MEG-01 tratadas o no con 10 nM PMA (resultados no mostrados). Los resultados confirmaron que la inducción con PMA incrementa de forma más notable los niveles de GPIIIa que los de GPIIb.

Resultados

Figura 48

RELACIÓN ENTRE NIVELES DE RNAm Y EXPRESIÓN EN SUPERFICIE DE GPIIb Y GPIIIa EN LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MEG-01

INDUCIDA POR PMA

0 1 2 3 4 In cremen to d e exp resió n en su p e rficie

(Cociente del canal medio de fluorescencia)

0 1 10 40 PMA (nM) GPIIIa GPIIb 0 1 2 3 4

Incremento de RNA mensajero

(∆ RQ-GP/ ∆ RQ- β-Actina) 0 10 PMA(nM) GPIIIa GPIIb Citometría de flujo RT-PCR cuantitativo

Células MEG-01 tratadas con 1nM, 10nM o 40 nM de PMA durante 4 horas o 1 hora en el último caso, se incuban durante tres días sin PMA antes de analizar el contenido de GPIIb y GPIIIa mediante citometría de flujo (Panel superior) con anticuerpos anti-GPIIb y anti-GPIIIa. Al mismo tiempo, se extrajo RNA total de células MEG-01 sin tratar o tratadas con 10 nM PMA. Se cuantificó el RNAm de GPIIb y GPIIIa por RT-PCR con sondas TaqMan específicas, normalizándose los resultados con los valores de β-Actina (Panel inferior). Los resultados muestran los cocientes de los valores obtenidos en células tratadas con PMA entre los de células control sin tratar.