Como paso previo a cualquier tipo de estudio funcional hemos realizado una determinación cuantitativa de los niveles de RNA mensajero de GPIIb y GPIIIa en las plaquetas de los pacientes. Este proceder encuentra justificación en el hecho de que las mutaciones que generan un codón de terminación prematuro, con gran frecuencia, dan lugar a un procesamiento alternativo del RNAm y/o alteran la estabilidad de los transcritos (Dietz et al, 1993). La Tabla X muestra cómo las lesiones que generan un codón de terminación, cursan con una cantidad reducida de RNAm, mientras que las otras dos mutaciones presentaron niveles normales. En los casos de disminución o ausencia de RNAm de la subunidad mutada, es evidente que la falta de proteína es la etapa limitante para la expresión en superficie de GPIIb/IIIa por lo que no sería
Discusión
necesario realizar ningún tipo de estudio funcional. Respecto a los codones prematuros de terminación, en la actualidad es imposible predecir si alterarían la cantidad del mensajero que los contiene. Se han descrito mutaciones en GPIIb que generan codones de terminación prematuros que no alteran la cantidad de mensajero (Vinciguerra et al, 1996; Iwamoto et al, 1994) o que lo disminuyen de forma acusada (Tomiyama et al, 1995). Estas diferencias parecen deberse a que el efecto de la aparición de un codón de terminación depende de su posición, ya que cuanto más próximo esté al extremo 5' de la secuencia codificadora más inestable será el RNA mensajero (Cooper, 1993).
Tabla X
Contenido plaquetario de RNAm de GPIIb en los casos de tromboastenia estudiados
Disminución o ausencia de RNAm de GPIIb
Mutaciones que provocan la aparición de un codón stop
IIb/exón 2 288delC desplazamiento marco de lectura-Stop
IIb/exón 19 C1882→T Arg597→Stop
Cantidad normal de mRNA
Mutaciones puntuales que dan lugar a la sustitución de un solo residuo
IIb/exón 21 T2113→C Cys674→Arg
IIb/exón 12 G1063→A Glu324→Lys
Los casos con cantidades normales de mensajero fueron sometidos a estudios funcionales mediante transfección de los cDNAs que codifican las subunidades
Discusión
normal y mutada en células de ovario de hámster chino (CHO). En este tipo de estudio, hemos valorado la capacidad de las subunidades mutadas para formar heterodímeros y la capacidad de los complejos GPIIb/IIIa recombinantes, normales o mutados, para expresarse en la superficie de las células transfectadas. La expresión superficial de GPIIb/IIIa fue analizada mediante citometría de flujo y/o marcaje de células intactas con biotina seguido de inmunoprecipitación de GPIIb y/o GPIIIa con monoclonales específicos. La síntesis y/o acúmulo intracelular de subunidades se detectó mediante marcaje de los lisados celulares totales. La Tabla XI resume algunos de los hallazgos más importantes de este tipo de estudios.
Tabla XI
Bases moleculares del fenotipo tromboasténico
Mutación Tipo de TG Mecanismo
GPIIb [delC288] I Ausencia de RNAm-GPIIb
GPIIb / Arg597→Stop I Ausencia de RNAm-GPIIb GPIIb / Glu324→Lys I Ausencia de heterodimerización
GPIIb / Cys674→Arg II Alteración del plegamiento, procesamiento y tráfico intracelular
Ninguna Variante Alteración de señalización? *
* La ausencia de mutaciones en GPIIb/IIIa junto con la falta de agregación en respuesta a agonistas, hace suponer que existe una perturbación en el mecanismo señalización intracelular común a los receptores de los agonistas que intervienen en el proceso de activación plaquetaria.
5.2.1. Clasificación por subtipos de la tromboastenia de Glanzmann
Discusión
En un principio, Zucker y colaboradores demostraron que las plaquetas de los pacientes tromboasténicos no se adherían ni extendían normalmente sobre un cristal y su contenido de fibrinógeno plaquetario era de aproximadamente un 10-25% del valor normal (Zucker 1964; Zucker et al, 1966). Este hecho condujo a la identificación de fallos en la fijación de fibrinógeno y, finalmente, al complejo GPIIb/IIIa como responsable de la patología tromboasténica (Nurden y Caen, 1974); razón por la cual, la forma más común de clasificación de las tromboastenias es la basada en el contenido plaquetario de GPIIb/IIIa (George et al, 1990). En las tromboastenias de tipo I existe una ausencia total de receptor; las de tipo II muestran niveles de receptor inferiores al 20% y, finalmente, las llamadas "variantes" tienen cantidades normales de complejo GPIIb/IIIa pero incapaz de fijar fibrinógeno de forma eficiente. Actualmente, los estudios genéticos y bioquímicos han permitido clasificar esta patología de acuerdo a otros criterios que permiten un conocimiento más preciso de la etiopatogenia de esta enfermedad. La Tabla XII recoge las distintas posibilidades de subclasificación de las tromboastenias. Nosotros hemos tratado de identificar las bases moleculares de los casos de fenotipo tromboasténico objeto de este estudio y encuadrarlos dentro de uno de los subtipos descritos. Nuestro estudio es el primero en que se ha determinado de modo cuantitativo el contenido plaquetario de mensajeros de GPIIb y/o GPIIIa. De igual forma, como discutiremos más adelante, hemos determinado que la interacción de subunidades mutadas con proteínas chaperonas del retículo endoplasmático son la causa de la disminución de la velocidad de tránsito de complejos GPIIb/IIIa hasta la membrana plasmática y pueden provocar un efecto negativo en condiciones de heterocigosis. Parece importante considerar este último aspecto como otro criterio de subclasificación en el estudio de las tromboastenias
Discusión
Tabla XII
Criterios de subclasificación de la tromboastenia de Glanzmann
I. DEFECTOS DE DNA A. Tipo de lesión
B. Topografía de la lesión C. Efecto de la lesión II. SUBUNIDAD AFECTADA III. RECEPTOR(ES) AFECTADOS A. GPIIb/IIIa (αIIbβ3) B. αvβ3
IV. DEFECTO BIOSINTETICO
A. Estabilidad y niveles de RNA mensajero
B. Síntesis, plegamiento o estabilidad de polipéptidos C. Formación de complejos
D. Estabilidad de complejos E. Maduración de complejos F. Tráfico intracelular de complejos V. ALTERACIÓN FUNCIONAL DE GPIIb/IIIa A. Cuantitativa
B. Cualitativa
1. Complejos inestables
2. Mutaciones que perturban la fijación del ligando
3. Mutaciones puntuales que afectan a la activación de GPIIb/IIIa por agonistas
5.3. ANÁLISIS FUNCIONAL DE LAS MUTACIONES ASOCIADAS CON