En los explantes colocados en el medio de cultivo para la formación y diferenciación de los embriones somáticos, a partir de los 40 días de cultivo se observaron pequeñas estructuras de coloración amarillo intenso sobre los callos cultivados con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP y a los 50 días de cultivo en un gran número de callos se observó la presencia de ESAF y ESBF (Figura 5).
Figura 5. Embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King obtenida con 1.0
mg.L-1 de 6-BAP a los 50 días de cultivo (A. Callo con ESAF y B. Callo con ESBF).
La embriogénesis somática de alta frecuencia se caracterizó por la presencia de grupos de un gran número de proembriones y también de embriones somáticos en etapa globular de color blanco amarillento; sin embargo, en la embriogénesis somática de baja frecuencia se observaron embriones somáticos aislados en diferentes etapas de desarrollo.
A los 60 días se observó que algunos de los embriones somáticos formados a partir de los callos, en el medio de cultivo para la formación y diferenciación con 1.0 mg.L- 1 de 6-BAP, se encontraban en la etapa de torpedo (Figura 6 A). En todos los
tratamientos se observó a los 80 días de cultivo un alto porcentaje de embriones somáticos en etapa cotiledonal (Figura 6 B).
Figura 6. Embriones somáticos de Swietenia macrophylla king formados a partir de callos
con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP (A. Embriones somáticos a los 60 días de cultivo y B. Embriones
somáticos en etapa cotiledonal a los 80 días de cultivo).
A B
A B
Al comparar el efecto del 6-BAP sobre la embriogénesis somática indirecta (Tabla 4),
se encontró que en los tratamientos donde se adicionaron las concentraciones de esta citoquinina al medio de cultivo los porcentajes de ESAF y ESBF fueron superiores a los obtenidos en el control.
Los valores más altos del número de callo con ESAF y ESBF se presentaron en los callos que fueron cultivados en el medio de cultivo con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP, este tratamiento manifestó diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Tabla 4. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP en el desarrollo de la embriogénesis somática indirecta en Swietenia macrophylla King a los 60 días de
cultivo
Callo con Embriogénesis somática de alta frecuencia
Callo con Embriogénesis somática de baja frecuencia Concentraciones
de 6-BAP (mg.L-1)
No. callo/frasco Porcentaje No. callo/frasco Porcentaje
0.0 1.43 c 23.81 % 0.67 d 11.13 %
0.5 2.77 b 46.15 % 1.71 c 28.56 %
1.0 3.18 a 53.01 % 2.04 a 33.92 %
2.0 2.82 b 47.00 % 1.83 b 30.61 %
E. E. ± 0.04 ± 0.02
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
Los resultados demuestran que la adición de 6-BAP al medio de cultivo incrementa significativamente la formación de embriones somáticos en los callos originados a partir de secciones de cotiledones. Nos muestran también que este proceso se logra sin la presencia de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo. Resultados similares fueron descrito en otras especies Meliaceas como:
Azadirachta excelsa y Azadirachta indica, donde se señala que los callos cultivados
somáticos superior con respecto a los que se cultivaron en el medio de cultivo sin reguladores de crecimiento (Giagnacovo et al., 2001; Salvi et al., 2001).
En cuanto al número de embriones somáticos por callo, los valores máximos se obtuvieron en los callos que se cultivaron en un medio de cultivo con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP, con diferencias con respecto a los demás tratamientos (Tabla 5). La presencia de los embriones somáticos en los callos cultivados con esta citoquinina, demostró el efecto de la misma en la formación de embriones somáticos en
Swietenia macrophylla King.
Tabla 5. Efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el número de embriones somáticos por callo y el desarrollo de los embriones somáticos en
Swietenia macrophylla King a los 80 días de cultivo
Concentraciones
de 6-BAP (mg.L -1) No. de ES por callo No. de ES por callo en etapa cotiledonal Porcentaje de ES en etapa cotiledonal
0.0 18.73 d 15.58 d 83.21 %
0.5 31.62 c 27.58 c 87.23 %
1.0 43.35 a 40.37 a 93.12 %
2.0 36.18 b 32.83 b 90.74 %
E. E. ± 0.36 ± 0.34
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
En la embriogénesis somática en Meliaceas como Cedrela fissilis Vellozo y Cedrela odorata utilizan el 6-BAP en los medios de cultivo para la formación y
diferenciación de embriones somáticos. En estas especies los valores más altos del número de embriones somáticos por callo fueron obtenidos con 1.0 mg.L-1de 6-BAP (Da Costa et al., 2002; Muños, 2003).
Al evaluar el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre el desarrollo de los embriones somáticos formados a partir de callos a los 80 días de cultivo, se observó que un alto porcentaje de embriones somáticos alcanzaron la etapa
cotiledonal en todos los tratamientos. El valor más alto del número de embriones somáticos por callo en esta etapa de desarrollo, se presentó cuando se añadió al medio de cultivo 1.0 mg.L-1 de esta citoquinina, con diferencias significativas con respecto a los otros tratamientos.
Con los resultados obtenidos se demostró el efecto del 6-BAP en el desarrollo de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King formados a partir de callos.
En especies leñosas como Eucalyptus globulus Labill y Quercus suber L, la adición
de concentraciones de 6-BAP en el rango de 0.5–1.5 mg.L-1 al medio de cultivo incrementó los valores de embriones somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal (Pinto et al., 2002; Hernández et al., 2003).
Resultados similares respecto a la utilización de bajas concentraciones de 6-BAP (0.5 - 1.0 mg.L-1) para la diferenciación de embriones somáticos fueron obtenidos en otras especies leñosas como Psidium guajava L. cv. EEA 18-40 y Coffea arabica
L. cv. Caturra rojo (Vilches et al., 2001; Barbón et al., 2002).
Estos resultados demostraron que la formación y diferenciación de embriones somáticos a partir de callos en Swietenia macrophylla King se favoreció con la
adición de 6-BAP al medio de cultivo. Con 1.0 mg.L-1 de 6-BAP se obtienen los mayores porcentajes de ESAF y ESBF, así como el mayor número de embriones somáticos por callo y embriones somáticos que alcanzaron la etapa cotiledonal.
4.3. Maduración de embriones somáticos de Swietenia macrophylla King
4.3.1. Efecto de la deshidratación en la maduración de los embriones somáticos
Al evaluar el efecto de los diferentes tiempos de deshidratación en la maduración de los embriones somáticos de Swietenia macrophylla King a los 60 días de
transferidos al medio de cultivo MS modificado, observamos que en los explantes que fueron deshidratados durante 72 y 96 horas el porcentaje de supervivencia disminuyó. Los valores más bajos de esta variable se presentaron en el tratamiento donde los embriones somáticos fueron expuesto al mayor tiempo de deshidratación (Tabla 6). Resultados similares fueron obtenidos por Chand y Kumar (2001), los cuales realizaron estudios sobre la deshidratación de los embriones somáticos en la fase de maduración en la especie Hardwickia binata Roxb y demostraron que los
explantes expuestos a este proceso durante 72 o más horas posteriormente presentaron afectaciones en la supervivencia.
Tabla 6. Efecto de diferentes tiempos de deshidratación en la maduración de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King a los 60 días de cultivo
Supervivencia de los ES Germinación completa Embriogénesis somática secundaria Tiempo de deshidratación (horas). No.
ES/frasco Porcentaje (%) ES/frasco No. Porcentaje (%) ES/frasco No. Porcentaje (%)
0.0 20.00 a 100.00 11.14 a 55.72 8.06 40.31
24.0 20.00 a 100.00 10.24 b 51.18 7.96 39.81
72.0 18.20 b 91.00 7.27 c 36.37 8.12 40.63
96.0 15.17 c 75.86 4.28 d 21.43 8.23 41.19
E. E. ± 0.21 ± 0.22 N.S
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren estadísticamente para (p< 0.05) según la prueba de Duncan.
Cuando los embriones somáticos fueron expuestos a diferentes tiempos de deshidratación los porcentajes de germinación disminuyeron. El mayor valor de esta variable lo presentó el control y mostró diferencias significativas con el resto de los tratamientos. Con este resultado se demostró que en la especie Swietenia macrophylla King, la deshidratación de los embriones somáticos por el método
empleado y en los tiempos probados, influyó negativamente en la germinación. Este resultado no coincide con los obtenidos por Choi y Jeong (2003) los cuales plantean que en la especie Siberian ginseng se incrementaron los porcentajes de
germinación después de haber expuesto los embriones somáticos a 72 horas de deshidratación. Sin embargo, coincide con Kumria et al. (2003) quienes plantearon
que la deshidratación de los embriones somáticos en Gossypium hirsutum no indujo
respuesta positiva en la germinación.
Algunos autores han encontrado que con la exposición de los embriones somáticos a tiempos de deshidratación en el rango de 48–96 horas se reduce la embriogénesis somática secundaria asociada a los mismos en especies como en
Populus spp (Lakshmi, 1999) y Acacia caven (Marinucci et al., 2004). Sin embargo,
estos resultados difieren de los resultados obtenidos ya que con ninguno de los tres tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0 horas de deshidratación) se obtuvieron porcentajes de embriogénesis secundaria significativamente inferiores al control. Los resultados obtenidos demostraron que la deshidratación afectó la maduración de los embriones somáticos en Swietenia macrophylla King, ya que con los tres
tratamientos estudiados (24.0, 72.0, 96.0 horas de deshidratación) se lograron porcentajes de germinación inferiores al control.
4.3.2. Efecto de diferentes concentraciones de sacarosa en la maduración de