Lo s e xp e rime nto s d e FRET fue ro n re a liza d o s c o mo e nsa yo d e d iluc ió n d e so nd a s, utiliza nd o NBD-PE y Rh-PE c o mo so nd a s fluo re sc e nte s (Struc k, 1981), c o n la fina lid a d d e c a ra c te riza r si e l LPS se inte rc a la e n la b ic a p a lip íd ic a . La inte rc a la c ió n e n la me mb ra na d e mo lé c ula s no ma rc a d a s (e n e ste c a so e l LPS) a ume nta la d ista nc ia e ntre e l d o no r y e l a c e p to r, e vid e nc ia d o p o r la re d uc c ió n e n la tra nsfe re nc ia d e e ne rg ía , c o n un a ume nto e n la inte nsid a d d e e misió n d e l d o no r y una d isminuc ió n e n la inte nsid a d d e e misió n d e l a c e p to r.
Lo s e sp e c tro s d e lo s lip o so ma s d o b le me nte ma rc a d o s e n p re se nc ia y a use nc ia d e LPS se mue stra n e n la Fig ura IV.3A.2. Lue g o d e a g re g a r LPS a la susp e nsió n d e LUVs-DMPC ma rc a d o s c o n NBD-PE y Rh- PE, la inte nsid a d d e e misió n d e l d o no r a ume nta , ind ic a nd o la inc o rp o ra c ió n d e l LPS e n la me mb ra na d e l lip o so ma , y p o r e nd e d isminuye la e fic ie nc ia d e FRET. La c iné tic a d e l a ume nto e n la inte nsid a d d e e misió n e s muy rá p id a , o c urre se g und o s d e sp ué s d e l a g re g a d o d e l LPS. Lo s e xp e rime nto s fue ro n re a liza d o s utiliza nd o la misma re la c ió n mo la r líp id o -LPS usa d a e n lo s e xp e rime nto s d e Po te nc ia l
C a p ítulo IV: Inte ra c c ió n d e l LPS c o n me mb ra na s.
96
Ze ta (c o nsid e ra nd o q ue e n lo s MLVs só lo un 10% d e lo s líp id o s e stá n e xp ue sto s e n la b ic a p a e xte rna ).
En la fig ura IV.3A.3A p ue d e o b se rva rse q ue la e fic ie nc ia d e FRET e s d e l 90 % lue g o d e la inc o rp o ra c ió n d e l LPS a me mb ra na s d e LUVs- DMPC , a l a g re g a r LPS e n re la c ió n mo la r 35:1 líp id o :LPS. C ua nd o la c o nc e ntra c ió n d e LPS se inc re me nta 10 ve c e s, la e fic ie nc ia d e FRET e s d e l 65 %, c o nsid e ra nd o e n a mb o s c a so s una e fic ie nc ia d e FRET d e l 100% e n a use nc ia d e LPS.
C ua nd o e l LPS e s d isp e rsa d o e n una susp e nsió n sa lina d iluid a , se a g re g a fo rma nd o mic e la s. La C MC (c o nc e ntra c ió n mic e la r c rític a ) d e l LPS d e E. c o li 0111:B4 d e te rmina d a e xp e rime nta lme nte e s 22 μg LPS/ ml
Lo ng itud d e o nd a (nm) 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 In te n si d a d d e F lu o re sc e n c ia 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Fig ura IV.3A.2: Esp e c tro s d e e misió n d e fluo re sc e nc ia d e LUVs-DMPC d o b le me nte ma rc a d o s c o n NBD-PE y Rh-PE e n a use nc ia (- -) y e n p re se nc ia (- -) d e LPS e n re la c ió n mo la r 3.5:1 líp id o :LPS. La s mue stra s fue ro n e xc ita d a s a 465 nm (lo ng itud d e o nd a d e e xc ita c ió n d e l NBD- PE) y e l e sp e c tro d e e misió n se re g istró e ntre 480-600 nm.
C a p ítulo IV: Inte ra c c ió n d e l LPS c o n me mb ra na s.
(Aure ll, 1998). Existe g ra n c o ntro ve rsia e n la lite ra tura a c e rc a d e si e l LPS inte ra c c io na c o n me mb ra na s e n fo rma mo nó me ric a , c o mo a g re g a d o o a mb a s, e n p a rtic ula r e n a use nc ia d e LBP (Sc hro mm, 1995), (Mue lle r, 2004).
Te nie nd o e n c ue nta la sig uie nte re la c ió n:
∆E/ Eo = ∆S/ So = (- sLPS/ sL) x ([LPS]/ [L]) (EC . IV3A.1)
d o nd e sL e s la sup e rfic ie d e una mo lé c ula d e líp id o , sLPS e s la sup e rfic ie d e una mo lé c ula d e LPS, ∆S e s e l a ume nto e n la sup e rfic ie d e me mb ra na (So ) d e b id o a la inc o rp o ra c ió n d e una so la mo lé c ula d e LPS e n la me mb ra na , [LPS] e s la c o nc e ntra c ió n d e LPS, [L] c o rre sp o nd e a la c o nc e ntra c ió n d e líp id o s, ∆E e s e l c a mb io e n la e fic ie nc ia d e FRET (Eo ). La p e nd ie nte d e la g rá fic a ∆E/ Eo vs [LPS]/ [L] (-sLPS/ sL) d a la re la c ió n d e l a ume nto d e sup e rfic ie d e b id o a una mo lé c ula d e LPS c o mp a ra d a c o n e l inc re me nto p ro d uc id o p o r una mo lé c ula d e líp id o . C o nsid e ra nd o q ue e l p e so mo le c ula r p a ra e l LPS d e E. c o li 0111:B4 e s d e 10 kDa ,
d e te rmina d o p o r Aure ll y Winstro m (Aure ll, 1998), lo s va lo re s d e (-sLPS/ sL) c a lc ula d o s fue ro n 315 y 122,5 p a ra la s re la c io ne s mo la re s líp id o :LPS 35:1 y 3.5:1 re sp e c tiva me nte . La no line a lid a d e ntre la c o nc e ntra c ió n d e LPS y la d isminuc ió n d e FRET, p ue d e se r e xp lic a d a si LPS mo no mé ric o q ue se e nc ue ntra e n e q uilib rio c o n a g re g a d o s p o r e nc ima d e la C MC a una c o nc e ntra c ió n c o nsta nte , se inte rc a la e n la me mb ra na fo sfo lip íd ic a .
Da d o q ue e l p ro c e so d e inte rc a la c ió n d e l LPS e n me mb ra na s p ue d e e sta r re la c io na d o c o n la C MC , re a liza mo s lo s mismo s e xp e rime nto s d e FRET e mp le a nd o líp id o A, c o n me no r C MC q ue e l LPS y p o r lo ta nto me no r c o nc e ntra c ió n d e mo nó me ro , c o n e l fin d e d isc rimina r si e s e l mo nó me ro o e l a g re g a d o e l q ue inte ra c túa c o n la s me mb ra na s.
C a p ítulo IV: Inte ra c c ió n d e l LPS c o n me mb ra na s.
98
d e inte rc a la c ió n d e LPS, no c a mb ia la se ña l d e FRET, p o r lo ta nto p ue d e c o nsid e ra rse q ue la inte rc a la c ió n d e l líp id o A e n lo s LUVs-DMPC e s d e sp re c ia b le . Esto s re sulta d o s re fue rza n la hip ó te sis d e q ue la inte rc a la c ió n d e l mo nó me ro e n la s me mb ra na s lip íd ic a s e s re sp o nsa b le d e la d isminuc ió n d e l FRET.
A c o ntinua c ió n se e va luó la d e p e nd e nc ia e ntre e l p ro c e so d e inte rc a la c ió n d e l LPS y la c o mp o sic ió n lip íd ic a d e la me mb ra na . C o mo se mue stra e n la Fig ura IV.3A.4 la inte rc a la c ió n d e l LPS e n lip o so ma s d e DMPC (líp id o ne utro ) p ro vo c a una e fic ie nc ia d e FRET d e l 65 %. La p re se nc ia e n lo s lip o so ma s d e 10% d e PS (líp id o c a rg a d o ne g a tiva me nte ) o 20 % d e c o le ste ro l p ro mue ve una e fic ie nc ia d e FRET d e l 78 % y 70 %, re sp e c tiva me nte . La p re se nc ia d e c a rg a s ne g a tiva s e n
Fig ura IV.3A.3: Disminuc ió n d e la e fic ie nc ia d e FRET e n LUVs d o b le me nte ma rc a d o s c o n NBD-PE y Rh-PE.
Pa ne l A: LUVs-DMPC (100 µmo l) (- -), LUVs-DMPC + LPS a 35:1 (líp id o :LPS, mo l:mo l) (- -) y LUVs-DMPC + LPS 3.5:1(líp id o :LPS, mo l:mo l) (- -).
Pa ne l B: LUVs-DMPC (100 µmo l) (- -) LUVs-DMPC + líp id o A 35:1(líp id o :Líp id o A, mo l:mo l) (- -) y LUVs-DMPC + líp id o A 3.5:1(líp id o :Líp id o A, mo l:mo l) (- -) Ef ic ie n c ia d e F R ET ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 Ef ic ie n c ia d e F R ET ( % ) 0 20 40 60 80 100 120 DMPC Líp id o A 35:1 Líp id o A 3.5:1 DMPC LPS 35:1 LPS 3.5:! A B
C a p ítulo IV: Inte ra c c ió n d e l LPS c o n me mb ra na s.
la me mb ra na , a p o rta d a s p o r la PS, d isminuye la inte rc a la c ió n d e l LPS a c a usa d e la re p ulsió n e le c tro stá tic a e ntre a mb a s mo lé c ula s. Po r o tro la d o , la p re se nc ia d e c o le ste ro l mo d ific a la s p ro p ie d a d e s físic a s d e la s me mb ra na s d isminuye nd o e l á re a p o r mo lé c ula d e fo sfo líp id o o á re a p o r c a d e na hid ro c a rb o na d a (Alc) (Mc Into sh, 1989) y ta mb ié n a ume nta
e l mó d ulo d e c o mp re sib ilid a d iso té rmic o (KA) (Ne e d ha m, 1990), a mb o s
p a rá me tro s re sp o nsa b le s d e la d isminuc ió n e n la inc o rp o ra c ió n d e l LPS e n la s me mb ra na s, e n c o mp a ra c ió n c o n lip o so ma s d e DMPC p uro .