Conclusion of the study

Existen numerosos estudios, en los cuales se emplean agentes teratógenos como el AVP para generar un modelo de autismo (Faiella et al., 2000; Ingram et al., 2000; Kuwagata et al.,

comparación con los grupos control, señalando que este efecto es dependiente de la edad gestacional a la cual fueron expuestos al fármaco. En este contexto, la tasa de natalidad fue del 94.9% cuando la exposición se realizó durante el día embrionario 7 (E7), misma que se reduce hasta 40% cuando se realiza durante E9.5; estos mismos investigadores, indican que no existe cambios en la tasa de natalidad, si la exposición a este fármaco se realizó el día E12 o E15. Otro estudio donde se analiza la viabilidad de los fetos de rata el día E16, no reporta cambios en este parámetro evaluado en dos distintos grupos expuestos al AVP durante el día E9 o E11 (Kuwagata et al., 2009). El grupo de Ogawa (2007) observó una reducción en la viabilidad de los fetos de ratas durante el día E14, previamente expuestas al AVP durante día E9 y E11, en comparación con los animales control. Por otra parte, en el presente estudio encontramos que las hembras expuestas al AVP durante el día E12 presentan un éxito reproductivo del 38%, mientras que este parámetro fue de 72% en ratas inyectadas con SS durante este mismo día, mostrando una reducción del 44% entre ambos grupos experimentales. Lo anterior sugiere que bajo nuestras condiciones experimentales, se corrobora que la exposición prenatal al AVP reduce el éxito reproductivo y el número de crías viables al momento del nacimiento. Adicionalmente, en este estudio se observó que durante el día postnatal 14, edad a la cual se realizaron la inducción de las crisis epilépticas, las ratas tratadas prenatalmente con AVP presentan menor peso que las ratas control. Este hecho es similar a lo observado por otros autores al día de nacimiento (Faiella et al., 2000; Ingram et al., 2000; Roullet et al., 2013; Schneider y Przewłocki, 2005). Aunado a lo anterior, se ha reportado que la exposición in útero al AVP, reduce el peso y la talla de los fetos (Kuwagata et al., 2009). Vale la pena mencionar, que también existen reportes en distintos días de exposición al AVP (E7,E9, E12 y E15) donde no se encuentran diferencias en el peso corporal a las 4 semanas de vida (Kim et al., 2011). Una causa que podría explicar el bajo peso de las crías expuestas al AVP, es que las hembras expuesta a este fármaco en dosis altas (600mg/kg), muestran un perdida en la ganancia de peso durante la gestación, lo cual no sucede con dosis menores (Vorhees, 1987).

En cuanto al estudio de la susceptibilidad a las convulsiones causadas por el PTZ,

los resultados muestran que todos los sujetos utilizados tratados prenatalmente con SS o AVP convulsionaron en respuesta al PTZ. Sin embargo, se encontraron diferencias entre los grupos experimentales en la severidad de las convulsiones observadas, así como en la latencia y la duración a las mismas. En promedio las ratas tratadas con AVP presentaron

convulsiones mayores (severidad 4), similar a las observadas por Velisek et al., (1992). De igual forma, algunas ratas del grupo AVP y del grupo control mostraron patrones de convulsiones mayores (severidad 5), similares a las observadas por estos autores en ratas de distintas edades. Adicional a lo reportado por Velisek et al., (1992), se constató que tanto los individuos control, como los expuestos al AVP, pueden desarrollar SE. En el estudio referido anteriormente, el periodo de observación se limita a 30 minutos, motivo por el cual estos autores no reportan de una manera concreta el desarrollo de SE con la aplicación de PTZ. Otra razón, por la cual pudiera no haber reportes de SE utilizando el PTZ, es que la mayoría de las ratas control mueren poco después de presentar la CCTG, lo cual ocurre alrededor de 10 min después de la administración del PTZ. Este resultado sugiere que en los sujetos tratados con AVP, puede estar afectado algún mecanismo cerebral encargado de detener la actividad ictal, lo que promueve el desarrollo de actividad epiléptica continúa, i.e. estado epiléptico. A pesar de que ambos grupos, ya sea expuestos a SS o AVP, presentaron CCTG, en el grupo AVP estas crisis fueron visualmente más severas, ya que estuvo involucrada la extensión de los miembros anteriores y posteriores, aunado a que en este grupo se observó que un mayor número de ratas presentaron más de una CCTG, mientras que los miembros del grupo control solo extendieron los miembros posteriores, flexionaron los anteriores y solo algunos presentaron más de una CCTG. En el grupo control se observó la extensión de ambos miembros antes de morir en una segunda fase clónica- tónica generalizada, similar a lo reportado por Velisek et al., (1992). Las CCTG, fueron el tipo crisis más frecuentemente observado en este estudio. Llama la atención que Bolton et al.,

(2007) reporta en pacientes con TEA, la ocurrencia de CCTGs en el 88% de su población de estudio. De igual manera, Hara (2007), observó crisis parciales secundariamente generalizadas y convulsiones tónico-clónicas en pacientes con TEA. Ambos reportes apoyan el hecho de que este tipo de convulsiones pueden presentarse en asociación con el TEA y apoyan los resultados de este estudio, en el que ratas que fueron expuestas in útero al AVP, son capaces de generar CCTGs en respuesta de la aplicación del PTZ, un convulsivante caracterizado precisamente por generar este tipo de convulsiones.

Por otro lado, la susceptibilidad a las crisis convulsivas en los sujetos con TEA ha sido relacionada con el género, ya que algunos reportes mencionan una mayor incidencia de epilepsia en el género femenino cuando está en comorbilidad con el TEA, aunque se sabe

(Danielsson et al., 2005; Hughes y Melyn, 2005; Kanner, 1971, Bolton et al., 2011). Se ha reportado que la aplicación de dosis diarias no teratogénicas de AVP (250mg/kg) en ratas durante la ultima semana de gestación (E15-20), promueve cambios en la susceptibilidad al PTZ (50 mg/kg) en las crías en edades de 34 a 38 días de edad, en donde se observa un marcado dimorfismo sexual, ya que las hembras son menos susceptibles que los machos a convulsionar, además de que estos últimos muestran una mayor susceptibilidad comparados con los machos controles (Sobrian y Nandedkar, 1986). También, en ratas expuestas al AVP en el día E12, se ha demostrado por medio de convulsiones inducidas por electrochoques, un menor umbral convulsivo en los machos en comparación con las hembras del mismo grupo y los machos control (Kim et al., 2013). Por otra parte, renacuajos expuestos al AVP durante el neurodesarrollo, presentan una mayor frecuencia de convulsiones inducidas por PTZ en comparación con los controles (James et al., 2015). En el presente estudio, las ratas expuestas al AVP muestran una tendencia de la susceptibilidad a las convulsiones debido al género, ya que los machos fueron más susceptibles a presentar CCTG que las hembras. Es importante enfatizar, que las diferencias de género observadas en nuestro estudio, podría ser explicadas por la diferencia en la proporción de las ratas machos y hembras afectadas por AVP in útero. Nuestros resultados sugieren, que en el modelo de exposición prenatal al AVP, los machos son más sensibles a una reducción de la función inhibidora GABAérgica cerebral y como resultado de esto son más susceptibles a presentar convulsiones. Lo anterior, puede relacionarse a una menor expresión de la GAD67 (enzima responsable de la síntesis de GABA) en el hipocampo de ratas macho expuestos prenatalmente al AVP en comparación de las hembras, lo que sugiere que pueden existir mecanismos específicos de género (Kim et al., 2013).

Aunque existen muchos trabajos, donde se emplea el PTZ para la inducción de convulsiones, son pocos los que utilizan ratas de 14 días de edad. Klioueva et al., (2001) realizaron un estudio en ratas de 10 días de edad, y observaron que una dosis menor a la de este estudio (PTZ-50 mg/kg) produjo una baja incidencia de las CCTG (33%) y una mayor incidencia a las crisis mínimas (67%). En el presente estudio, se encontró que las ratas expuestas al AVP presentaron dos subgrupos con diferencias en la susceptibilidad a las convulsiones, el subgrupo AVP- (33%) y el subgrupo AVP+ (67%). Los resultados del estudio referido anteriormente, señalan que las convulsiones inducidas por PTZ muestran

una disminución dependiente de la edad, ya que a mayor edad mayor es susceptibilidad. Uno de los mecanismos discutidos por Klioueva et al., (2007), es que debido a la inmadurez cerebral, el sistema GABAérgico no ésta totalmente desarrollado, lo cual puede ocasionar el aumento de la susceptibilidad a las crisis. Por lo tanto, la ausencia de control inhibitorio sobre los procesos excitatorios en edades tempranas aumenta la vulnerabilidad de la neocorteza en desarrollo a la actividad convulsiva durante la ontogénesis postnatal. También, se ha reportado que la maduración de la barrera hematoencefálica (BHE) influye en su permeabilidad, y que las ratas de 15 días de edad presentan una BHE más permeable en áreas cercanas al hipocampo, hipotálamo y cerebelo en comparación con las ratas adultas (Ziylan et al., 1992). De manera similar, puede suceder en éste trabajo con las ratas tratadas con AVP, debido a que pueden presentar diferentes grados de madurez cerebral y mostrar diferencias en la susceptibilidad a las crisis, característica que pudiera estar asociada con la presencia de dos subgrupos AVP+ y AVP-. Por lo tanto, la exposición al AVP puede estar ocasionado un retraso en la maduración del sistema GABAérgico y la de la BHE en el subgrupo AVP+, lo que los hace más susceptibles a presentar CCTGs, o bien hacerlos resistentes a una sobreexictación y hacerlos menos sensibles como es el caso de las ratas AVP-. Estos datos pueden estar relacionados con los reportes epidemiológicos, que señalan que hasta el 35% las personas con TEA pueden presentar comorbilidad con epilepsia (Canitano, 2007; Danielsson et al., 2005; Hara, 2007; Stafstrom et al., 2011; Tuchman et al., 2010).

Por otro lado, la heterogeneidad en la susceptibilidad a las convulsiones en los sujetos expuestos prenatalmente al AVP observado en este estudio, puede relacionarse con lo observado en los pacientes con TEA, pues en éstos se han considerado numerosos factores vinculados a un mayor riesgo de padecer epilepsia, como lo es presentar retraso mental, las alteraciones motoras, aspectos epigenéticas y genéticos, contribuciones ambientales, síndrome hipotónico, entre otros (Tuchman et al., 2009). Se sabe que los pacientes con TEA que están en comorbilidad con algunas de las condiciones mencionadas previamente, tienen un mayor riesgo de presentar epilepsia, con una prevalencia de hasta el más del 60% de los casos (Danielsson et al., 2005; Levisohn, 2007; Stafstrom et al., 2012). Otra posible explicación de esta heterogeneidad que se observó en el subgrupo de ratas AVP, que presentaron menor severidad, pudiera ser que no todas las crías expuestas

como resultado diferencias en la susceptibilidad a las convulsiones inducidas por PTZ en comparación con el mismo grupo y el grupo control. En este contexto, como resultado de la exposición prenatal a letrozol, Olvera-Hernández et al., (2015) reportan dos subpoblaciones de ratas con diferente preferencia sexual (Olvera-Hernández et al., 2015), efecto que sugieren podría deberse a la diferencias en la cantidad de este fármaco que los fetos absorbieron in útero. Se sabe que la posición fetal intrauterina es un factor clave dentro de las diferencias entre individuos expuestos a fármacos durante la gestación. Fetos de ratas que se expusieron a cocaína, muestran diferentes cantidades de esta droga en el cerebro dependiendo de su localización, los fetos cercanos al cuello uterino presentaban niveles mayores en comparación de aquellos que estaban más lejanos a este (Del campo et al.,

1972). Lo cual quizá, puede ser relacionado a un mayor flujo sanguíneo del cuello del útero a los ovarios en ratas en gestación (Lipton et al., 1998). Finalmente, vale la pena resaltar que la presencia de ratas con AVP que exhibieron alta (67%) o baja (33%) susceptibilidad a las convulsiones, se asemeja a la prevalencia de individuos con TEA que están en comorbilidad con epilepsia (20-30%, Stafstrom et al., 2011; Bisson et al., 1988). Además, algunos datos en humanos con TEA a los que se le midió la capacidad de inhibición intracortical, han reportado un subgrupo que presenta una inhibición reducida, lo cual puede ser relacionado también con el amplio espectro comportamental observado en esta padecimiento (Oberman et al., 2011). Por lo cual podemos inferir que no todos los pacientes con TEA y no todos los sujetos tratados prenatalmente con AVP son propensos o vulnerables a presentar algún tipo de crisis. Otro de los objetivos de este estudio, fue evaluar la susceptibilidad de las ratas expuesta al AVP en el desarrollo de SE, un tipo de actividad epiléptica que se presenta con alta incidencia en la población pediátrica y que se puede modelar con uso de Li-PILO. Los datos obtenidos indican que no hay diferencias en la incidencia, severidad, latencia o duración del SE desarrollado en las ratas del grupo AVP con respecto al grupo control.

En ratas de 12 a 17 días de edad, con dosis de 170 a 380 mg/kg de PILO, se han observado conductas similares a las exhibidas por los dos grupos experimentales en este trabajo (clonus de los miembros delanteros, levantamientos y carreras que culminan en crisis generalizadas entre otros), (Priel et al., 1996). Una de las características comúnmente observadas en algunos individuos del grupo AVP, fue la pérdida de la postura durante el SE, lo cual no se observó con frecuencia en los sujetos control. Posiblemente, este comportamiento puede estar relacionado con alguna deformidad en algunas estructuras

cerebrales, como el cerebelo y el tallo cerebral, que comúnmente se han observado tanto en modelos experimentales como en humanos con TEA (Ingram et al., 2000; Ogawa et al., 2007; Rodier et al., 1997); considerando que éstas estructuras están involucradas en la coordinación, mantenimiento de la postura y el equilibrio (Blatt, 2012). Algunos estudios indican que el consumo de fármacos anticonvulsivantes como el valproato, carbamazepina, fenitoína, fenobarbital y lamotrigina durante la gestación, provoca un riesgo mayor al 15% de padecer malformaciones congénitas con respecto a la población general 2-3% (Clayton-Smith y Donnai, 1995; Kini, 2006; Meador et al., 2008). La prevalencia de malformaciones congénitas cuando se administran distintos fármacos anticonvulsivantes durante la gestación oscilan entre el 4.6 a 8.9% (Rasalam et al., 2005). Las malformaciones congénitas más comunes son: los defectos del tubo neural, cardiovasculares, vertebrales, músculo-esqueléticos, labio leporino, espina bífida, hernias, trigonocefalia, anomalías pulmonares y en las extremidades como polidactilia y sindactilia, fusión de costillas, bajo coeficiente intelectual, síndrome fetal del valproato, TEA, entre otros (Clayton-Smith y Donnai, 1995; Faiella et al., 2000; Kini, 2006; Meador et al., 2008; Rasalam et al., 2005). Otro posible factor, por el cual no se observaron diferencias en la susceptibilidad a las crisis epilépticas inducidas por Li-PILO, es que se ha reportado que el sistema colinérgico termina su desarrollo hasta la quinta semana posnatal (Coyke y Yamamura, 1976), y quizá la cantidad de receptores expresando en la segunda semana posnatal, no sea suficiente para observar cambios entre ambos grupos experimentales.