La evaluación de los niveles de transcripción para los genes codificantes de fenilalanina amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS) y chalcona isomerasa (CHI) durante la interacción con el patógeno, se realizó de acuerdo a las condiciones previamente descritas (2.2.9). Este análisis se llevó a cabo solo para aquellas enzimas que presentaron cambios significativos en términos de su actividad enzimática. Los cebadores usados para esta etapa de la investigación, son los que se describen en las tablas No. 7 y 8. Cada determinación se realizó usando triplicado biológico y duplicado analítico. Los resultados obtenidos después de la cuantificación absoluta se reportaron como número de copias / pg cDNA (Y. Lu et al. 2012). Se verificó que no se presentaran variaciones en la eficiencia de amplificación de muestras y patrones usando el algoritmo reportado por (Ramakers et al. 2003). Los resultados también se presentan como la relación de la expresión del inoculado con respecto al control (Desmond et al. 2008; Godard et al. 2009), para evaluar diferencias propias del proceso de inoculación con el patógeno. La comparación estadística de los resultados obtenidos de la cuantificación absoluta, se realizó en cada tiempo, para cada órgano de la planta, usando ANOVA de una sola via con el programa Statgraphics 5.1.
Tabla No. 8. Lista de cebadores usados para la cuantificación por PCR en tiempo real de los niveles de mRNA para los genes codificantes para fenilalanina amonio liasa
Nombre de la
proteína Cebadores Secuencia 5´ 3´
Tamaño del fragmento Fenilalanina amonio liasa PAL directo PAL reverso ACTTGGTCCCGCTTTCCTAC GTGAGGATCTCACCGTTGG 85 pbs
3.3. Resultados y Discusión
La presente etapa de esta investigación buscó profundizar sobre los componentes bioquímicos y moleculares que se activan durante la infección por Fod y que están asociados con la resistencia al marchitamiento vascular del clavel. Particularmente se evaluó si dentro de dichos mecanismos de defensa activa, se encuentra la biosíntesis de
flavonoides, metabolitos dinámicos que pueden cumplir diversos papeles en la defensa vegetal. La información adquirida en esta fase de la investigación, complementaba el panorama que se había generado en la etapa anterior en la que se había determinado que a nivel constitutivo, las variedades resistentes de clavel presentan una biosíntesis de flavonoides más activa que las variedades susceptibles (Ardila, S. T. Martinez, et al. 2013). Con este fin, se planteó el diagrama de flujo que se describió anteriormente (figura No. 10). Este se encuentra dividido en tres grandes etapas, la primera correspondiente al análisis de metabolitos, la segunda a las determinaciones de actividades enzimáticas y la tercera a la evaluación de los niveles transcripcionales. Es importante comentar que, con el fin de asegurar que las respuestas bioquímicas y moleculares estudiadas estuvieran relacionadas con diferencias en los niveles de resistencia de las variedades objeto de estudio, se hizo seguimiento del avance de la enfermedad durante cuatro semanas pos inoculación y se determinó al final de este periodo, los niveles de incidencia al marchitamiento de la enfermedad en cada uno de los tratamientos propuestos. Cada una de las etapas de esta fase de la investigación se presenta a continuación de manera independiente y finalmente se comparan en conjunto, con el fin de conocer el panorama general de la modulación espacio-temporal de las respuestas evaluadas, para cada una de las variedades en estudio.
Es importante resaltar que las condiciones de inoculación usadas en la investigación presente, han permitido evaluar respuestas asociadas a la resistencia del clavel en estudios previos (Higuera 2001; Ardila & Higuera 2005; Cuervo et al. 2009; Ardila et al. 2011). Se ha determinado que la inmersión de las raíces en una suspensión de conidias del hongo, además de semejar las condiciones que el patógeno usa para infectar las plantas en el campo, es la que presenta mayor efectividad en la infección, al comparar con otras técnicas de inoculación de raíces como el “drench“ o la inoculación directa del suelo (Higuera 2001). Considerando que se querían evaluar respuestas asociadas a defensa en tallos y raíces, otras técnicas de inoculación como las que son usadas directamente en el tallo, fueron descartadas. Dichas técnicas requieren además, del uso de cortes o punciones en este órgano (Niemann & Baayen 1988; Baayen & Niemann 1989), condiciones que generan respuestas al estrés no deseadas que pueden interferir con las respuestas a evaluar. La generación de heridas en papa (Solanum tuberosum) por ejemplo, puede desencadenar aumentos en enzimas involucradas en metabolismo de fenoles como las polifenoloxidasas (Thipyapong et al. 1995).
Durante este ensayo in vivo, los diferentes tratamientos propuestos se mantuvieron bajo las mismas condiciones ambientales de iluminación, temperatura y humedad (figura No. 12). Esto permitió, en el momento de realizar el análisis de resultados, tener en cuenta con base en los controles, el posible efecto que las condiciones ambientales pueden presentar en los parámetros de interés, pues es sabido que por ejemplo altos niveles de radiacion o altas fuerzas iónicas en la rizosfera, pueden afectar la biosíntesis de flavonoides (Ryan et al. 2002; Agati et al. 2011).
12Figura No. 12. Fotografías del ensayo in vivo a las 2 horas poinoculación. A) vista general del ensayo con las 600 plantas usadas para los 4 tratamientos. B) Vista superior de un recipiente con plantas de la variedad susceptible. C). Vista superior de un recipiente con plantas de la variedad resistente
3.3.1 Evaluación de incidencia del marchitamiento vascular
causado por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2 en las dos
variedades de clavel
La selección del material vegetal es un punto central en el éxito de cualquier estudio comparativo sobre mecanismos de defensa vegetales y debe considerar la inclusión de al menos 2 genotipos con diferencias marcadas en términos de la resistencia a la enfermedad en estudio (Wise et al. 2007). La selección de las variedades que fueron usadas en el presente estudio se realizó teniendo en cuenta la opinión de expertos de la empresa de floricultura Grupo Chia (comunicación oral con el Ingeniero agrónomo Alejandro Saavedra), quienes teniendo en cuenta su comportamiento en campo, han clasificado a la variedad Tasman como susceptible y a la variedad L.P Candy como
resistente al marchitamiento vascular. Considerando su resistencia a la enfermedad, esta última variedad ha sido usada como referente en otras investigaciones en las que se han estudiado algunos cambios químicos que se presentan en la planta durante la inoculación con el patógeno (Higuera 2001).
Adicional a los estudios previos y los reportes de la empresa floricultora proveedora del material vegetal sobre el comportamiento de las variedades Tasman y LP Candy en campo, se confirmó bajo las condiciones particulares de inoculación de este ensayo, que efectivamente estas variedades se comportan diferencialmente en términos de la resistencia a la enfermedad. Esto era importante considerando que la presión de inóculo que se usó en el presente estudio, es superior a la comúnmente encontrada en el suelo usado para los cultivos. Es por ello que se realizó una evaluación visual de la incidencia de síntomas en las plantas controles e inoculadas de las variedades estudiadas, a tiempos posteriores a los seleccionados para realizar los muestreos, cuando se espera, se inicie la expresión de la sintomatología típica de la enfermedad.
Se determinó que a las 4 semanas posinoculación, la variedad susceptible inoculada, presentó un proceso de marchitamiento evidente, con inclinación del tallo y amarillamiento de las hojas del tercio inferior con visibles síntomas de deshidratación, en un 87 % de los esquejes. Para las plantas control de esta misma variedad, un 14% de los esquejes presentaban algún tipo de amarillamiento leve en sus hojas, el cual no fue asociado con los síntomas típicos de marchitamiento. (figura No. 13. T3 y T4). En el caso de la variedad resistente, solamente se presentó este mismo amarillamiento leve en algunas de las plantas control e inoculadas, que correspondieron al 14 y 20% del total, respectivamente (figura No. 13. T1 y T2). Este leve amarillamiento, que solo se presentó en algunas de las hojas, no fue generalizado ni considerado grave, ya que aquellas plantas que lo presentaban, se recuperaron posteriormente del mismo y fue asociado a la adaptación a alguna condición ambiental del ensayo en el momento de la evaluación (4 semanas posinoculación). Es importante resaltar que la evaluación de las respuestas bioquímicas se realizó a tiempos tempranos (máximo a 4 dias posinoculación), periodo en el cual, tallos, raíces y hojas, presentaron una apariencia sana y vigorosa para ambos genotipos estudiados. En dichos tiempos se espera se presenten los evetnos tempranos asociados con la resistencia a la enfermedad (Beckman 2000; Zhou & F. Wu 2009; Mandal et al. 2008; Van Pelt-Heerschap & Smit-Bakker 1999; Morkunas et al. 2011).
13Figura No. 13. Incidencia del marchitamiento vascular causado por Fod durante el ensayo in vivo con las variedades T1) variedad resistente control, T2) variedad resistente inoculada, T3) susceptible control, T4) Susceptible inoculada.
Finalmente, a las 8 semanas posinoculación, la presencia de los síntomas se evidenció solamente en la variedad susceptible inoculada en la que el 100% de los individuos evaluados (15 en total) presentaron un amarillamiento completo hasta el tercio superior, con evidente pardeamiento del haz vascular del tallo y aspecto leñoso y hueco del mismo, que les ocasionó la muerte. Esto se pudo observar mediante cortes transversales realizados en algunas plantas seleccionadas comparadas con los respectivos controles (tabla No. 9). Vale la pena anotar, que en este tiempo posinoculación, las plantas controles de las dos variedades y las de la variedad resistente inoculada, no presentaron la sintomatología típica del marchitamiento vascular. El corte transversal de la variedad resistente inoculada, permitió evidenciar a su vez, la presencia de un anillo café en los tejidos vasculares, típico de la activación de los mecanismos asociados con lignificación y oxidación de compuestos fenólicos (tabla No. 9).
Bajo esta evidencia experimental, se confirmaron a nivel fisiológico, las diferencias en los niveles de resistencia para las variedades objeto de estudio y se generó la confianza
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 T1 T2 T3 T4 INCIDE N CIA D E A M A R IL LA M IE N TO ()% p lan tas co n r e sp e cto al to tal) TRATAMIENTO
necesaria para asociarlas con los resultados de los parámetros bioquímicos y moleculares que se evaluaron.
Tabla No. 9. Cortes transversales de tallos para las variedades de clavel estudiadas, controles e inoculados a las 8 semanas posinoculación con Fod
Control Inoculado Variedad Susceptible Tasman Variedad Resistente L.P Candy