2.4 Stability of the DAP MPC Controller
2.4.1 Rate-based Contractive MPC
Los análisis estadísticos multivariados se constituyen en una herramienta de interés para la clasificación y agrupamiento de genotipos vegetales, teniendo en cuenta parámetros de su metabolismo secundario (Hossain et al. 2011). De acuerdo con el análisis de componentes principales para los parámetros asociados a la biosíntesis de flavonoides en el clavel (figura No. 9A), con excepción de la variedad Komashi Blanco (R), la cual se encuentra en el lado derecho de la gráfica, el PC1 (62.6%) permite agrupar las variedades en función de su nivel de resistencia al marchitamiento vascular. De esta manera las variedades resistentes se encuentran agrupadas hacia el lado izquierdo de la gráfica, mientras que las variedades susceptibles lo hacen al derecho. Por otro lado, el PC2 (19.8%), permite explicar la variación propia determinada por la localización de la finca y el suelo usado en el enraizamiento. Esto considerando que las variedades
provenientes de la finca 1 (Grupo Chia-Tocancipa) se encuentran en la parte superior de la gráfica, mientras que las de la segunda finca (Cota-SB Talee) lo hacen en la parte inferior. A pesar de que (L. S. Wu et al. 2009) no encontraron diferencias importantes en los niveles de flavonoides en Houttuynia cordata en función de la región geográfica, se ha reportado que las condiciones ambientales, el suelo de la siembra, la humedad y otros factores externos pueden determinar los niveles de los metabolitos secundarios, entre ellos los flavonoides (Winkel-Shirley 2002; J.-T. Lin et al. 2010; Agati et al. 2012; Ballizany et al. 2012). Este es el caso de Glycin tomentella, en donde se determinó que el suelo usado en la siembra afecta los niveles de algunos flavonoides en raíces (J.-T. Lin et al. 2010).
9Figura No. 9. Análisis de componentes principales para metabolitos, actividades enzimáticas y niveles
transcripcionales para el metabolismo de flavonoides en raíces de clavel. A) Distribución de variedades de clavel en los componentes de variación. B) Distribución de las variables evaluadas en los componentes de variación (Gráfica de cargas o loadings)S=susceptible y R= Resistente a Fod
Considerando que el componente PC1 permitió explicar la mayor parte de la variación de los resultados obtenidos, con un 62.6%, se propone que existe una relación entre los niveles de resistencia a la enfermedad y la biosíntesis de flavonoides a nivel de la raíz. Este resultado tiene potenciales aplicaciones considerando que una agrupación de variedades resistentes y susceptibles con base en los parámetros asociados al metabolismo secundario, puede ser una herramienta candidata para la discriminación de variedades en función de la resistencia a la enfermedad (figura No. 9 A). La aplicación
PC1 PC2 Act CHS mRNA CHS mRNA CHI Act PAL Act CHI Gioele (R) Komashi (R) Topacio (R) Esperia (R) Tasman (S) Star (S) Spitfire (S) Bellisima (S) L.P Candy (R) PC1 PC2 Resistencia Susceptibilidad Finca 1 Finca 2 A B
del PCA para la clasificación de variedades de cebada (Hordeum vulgare L) usando como variables los contenidos de fenólicos, flavonoides y actividad antioxidante, se ha planteado como una alternativa para la selección de variedades con características organolépticas de interés (H. Zhao et al. 2008). En general, el PCA basado en diferencias en el contenido de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante está siendo usado para la clasificación de variedades de diferentes especies vegetales (C. Xu et al. 2010; Hossain et al. 2011; Bernaert et al. 2012). Reportes recientes han incluido también para este tipo de clasificaciones, datos tanto a nivel de actividades enzimáticas y niveles de transcripción (Thill et al. 2012). Esto se debe a que la evaluación conjunta de las rutas biosintéticas a nivel de la presencia de proteínas activas (actividad enzimática) y niveles de mRNA, permite evaluar de manera simultánea cuáles son aquellos posibles puntos de regulación de la ruta. Es importante citar que a dicho patrón de clasificación usando PCA, reportado por esta investigación, solo se escapa la variedad resistente Komashi blanco, la cual presentó niveles intermedios de flavonoides, actividad antioxidante, actividad de la enzima CHS y niveles transcripcionales de CHI. Se sabe, por información de los cultivadores, que dicha variedad presenta también niveles menores de resistencia a la enfermedad en campo.
La gráfica de distribución de variables (figura No. 9B), muestra cuales son las principales variables que influyen sobre la generación de los componentes generados (PC1, PC2, PC3, etc). En este caso se evidencia que las variables mRNACHS y Act CHS, son las que tienen un mayor efecto sobre los componentes PC1 Y PC2. Esto nos indica que la distribución de variedades susceptibles y resistentes en la figura 9A, está influenciada en gran medida, por los niveles de actividad y transcripcionales de la enzima chalcona sintasa. Bajo estos resultados se puede concluir que los niveles de esta enzima, son importantes en el agrupamiento estadístico realizado y generan particular interés cuando se requiera seleccionar un parámetro con el fin de profundizar en el papel del metabolismo de flavonoides en la resistencia del clavel.
De acuerdo con esta fase de la investigación, se propone que uno de los componentes de la resistencia del clavel al marchitamiento vascular, es una mayor biosíntesis constitutiva de flavonoides a nivel de la raíz, proceso que al parecer está regulado a nivel enzimático por las enzimas CHI y CHS. Esta propuesta se realiza teniendo en cuenta la naturaleza poligénica de la resistencia del clavel al marchitamiento vascular reportada (Baayen et al. 1991), en donde se ha determinado que son varios los componentes
génicos que determinan el fenotipo resistente en el clavel. Así mismo, se propone que la biosíntesis de estos metabolitos puede llegar a ser un potencial marcador de resistencia que deberá ser evaluado en un mayor número de variedades con el fin de avanzar en la generación de marcadores para la selección de variedades de clavel resistentes al marchitamiento vascular.
2.4. Conclusiones
Las condiciones seleccionadas para la extracción de flavonoides totales y actividad antioxidante a partir de tallos y raíces de clavel, incluyen un tratamiento con metanol al 80% y ultrasonido por 15min.
Los niveles constitutivos de flavonoides y actividad antioxidante en clavel fueron mayores en raíces que en tallos para todas las variedades evaluadas, indicando que existe una regulación órgano dependiente de la biosíntesis de este tipo de metabolitos, determinada por las necesidades adaptativas de la planta.
La actividad antioxidante obtenida a partir de raíces de clavel y evaluada mediante los métodos espectrofotométricos, está asociada a la presencia de metabolitos de tipo fenólico y/o flavonoide, tal y como ha sido reportado para otras especies vegetales. Los niveles constitutivos de flavonoides y actividad antioxidante en raíz, son superiores en las variedades resistentes al comparar con las susceptibles, indicando un posible papel de dichos metabolitos en los mecanismos de defensa pasiva asociada con la resistencia al patógeno.
Los niveles de actividad CHS y CHI están asociadas con resistencia al marchitamiento vascular en las variedades evaluadas, indicando que a nivel constitutivo, estas enzimas regulan la generación de los metabolitos de tipo flavonoide y capacidad antioxidante en las raíces del clavel. Dicho comportamiento se sustenta a nivel estadístico en especial para la enzima CHI de acuerdo a la correlación entre los niveles de actividad enzimática y metabolitos.
Los niveles transcripcionales de los genes codificantes para CHS y CHI están asociados con resistencia a la enfermedad en las variedades estudiadas y con la actividad para las
enzimas que dichos genes codifican, en especial para la CHS, para la que se encontró una correlación estadística entre actividad enzimática y niveles de mRNA.
De acuerdo con los análisis estadísticos multivariados se puede concluir que el PCA permitió agrupar las variedades de clavel objeto de estudio en esta investigación, en función de la resistencia a la enfermedad, posicionándose éste como un posible marcador para la selección de variedades resistentes al marchitamiento vascular.
La biosíntesis de flavonoides a nivel de las raíces del clavel está asociada con la resistencia al marchitamiento vascular y está mayormente determinada por la transcripción de los genes codificantes para las enzimas chalcona sintasa y chalcona isomerasa, en este organo, primer punto natural de contacto entre la planta y el patógeno.