Los protocolos de caracterización de niveles de resistencia a insectos y enfermedades utilizados en este trabajo están avalados por la NAAIC de los Estados Unidos de Norteamérica (O´Neill, 1991, Berberet et al., 1991a;b). Las determinaciones se realizaron sobre las poblaciones C0 y C4 representadas por 50 plántulas distribuidas equitativamente en dos surcos de bandejas plásticas de 40x30x15 cm. Como sustrato se utilizó una mezcla de suelo y mantillo, esterilizada en autoclave durante 2 h a una presión de 2 atm. En cada prueba de resistencia se emplearon cuatro bandejas, cada una correspondiente a una repetición. Se utilizaron testigos resistentes y susceptibles, de acuerdo a cada prueba, cada uno representado por dos surcos y 50 plántulas por bandeja. Inicialmente se sembraron 80 semillas, ajustando el número final a 50 a través del raleo de las plántulas sobrantes.
2.5.1.1 Resistencia a pulgón azul (PA)
La población de pulgones (ninfas y adultos) fue recolectada de pasturas de alfalfa en la E.E.A. Manfredi mediante golpe de plantas sobre una bandeja plástica. Luego en el laboratorio y con ayuda de una lupa y una pinza, se seleccionaron los pulgones azules más sanos y vigorosos. Seguidamente, y a fin de purificar la colonia de otros insectos, parásitos y/o enfermedades, los pulgones fueron puestos en cuarentena sobre tallos de alfalfa que habían sido previamente lavados con alcohol al 70 % durante 30 s y posteriormente con hipoclorito de sodio al 0,5 % por otros 30 s. Una vez purificada, la colonia de pulgones fue multiplicada en una cámara bajo condiciones controladas (16 h luz y 22 ± 4 °C) sobre tallos de alfalfa, preparados como se describió anteriormente. Durante el proceso, los tallos
63 fueron reemplazados por otros nuevos al menos dos veces por semana. Se utilizó como testigo resistente el cv CUF 101 y como susceptible el cv Costera SP INTA. Para la caracterización de la resistencia, las bandejas fueron infestadas con al menos dos pulgones azules por plántula un día después de la emergencia (Figura 12). Los pulgones se mantuvieron en las bandejas por un tiempo promedio de 25 días, al cabo de los cuales se procedió a la categorización de las plántulas según su estado y sintomatología: 1- Resistente: plántulas altas, hojas normales; 2-Resistente: plántulas altas, hojas pequeñas; 3- Resistente: plántulas moderadamente altas, hojas pequeñas y deformadas; 4-Susceptible: plántulas cortas; hojas pequeñas, deformadas, usualmente cloróticas; y 5-Susceptible: plántula muerta. De acuerdo al número de plántulas en cada categoría y al número total de plántulas emergidas, se calculó el % de resistencia de la población según la ecuación:
% resistencia = ∑ plántulas categorías 1-3 / total de emergidas
Figura 12. Protocolo de selección para resistencia a A. kondoi y T. maculata: a) cría de pulgones en condiciones controladas sobre tallos de alfalfa; b) y c) infestación de plántulas y desarrollo de daño; d) identificación de genotipos resistentes (R) y susceptibles (S).
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2.5.1.2 Resistencia a pulgón moteado (PM)
La obtención de la población de pulgones se realizó de la misma manera descripta para pulgón azul, aunque bajo diferentes condiciones ambientales: 18 h de fotoperíodo y 26 ± 4 °C. Se utilizaron los mismos testigos resistente (CUF 101) y susceptible (Costera SP INTA). Para la caracterización, las bandejas se infestaron con al menos dos pulgones moteados por plántula en el estado de hoja unifoliolada (aproximadamente a los siete u ocho días después de la emergencia). Los pulgones permanecieron en las bandejas por un tiempo promedio de 18 días, al cabo de los cuales se realizó la categorización de las plántulas según una escala de 1 a 5, donde 1 y 2- Resistente: plántulas con al menos una hoja verdadera; 3-Resistente: plántulas con muy poco desarrollo; 4-Susceptible: plántulas vivas pero sin formación de hoja verdadera; y 5-Susceptible: plántula muerta. De acuerdo al número de plántulas en cada categoría y al número total de plántulas emergidas, se calculó el porcentaje de resistencia de la población según la ecuación:
% resistencia = ∑ plántulas categorías 1-3 / total de emergidas
2.5.1.3 Resistencia a antracnosis (AN)
Las bandejas con las plántulas a evaluar fueron colocadas en invernáculo con fotoperiodo de 16 h y 23 °C de temperatura promedio. Se utilizó como testigo resistente el cv ARC y como testigo susceptible el cv Costera SP INTA. La inoculación con el patógeno se realizó asperjando las bandejas con una suspensión de esporas del patógeno obtenidas a partir de un cultivo puro C. trifolii. Para el recuento inicial de esporas se empleó una cámara de contaje (rayado Neubauer) con la ayuda de un microscopio. Seguidamente, se ajustó el volumen final de la suspensión para llegar a una concentración de 2x106 esporas ml-1 (O´Neill et al., 1989), según la siguiente ecuación:
f f i
i V C V
C
donde: Ci es concentración inicial; Vi es volumen inicial; Cf es concentración final y Vf es volumen final.
65 La inoculación se efectuó 10 días después de la siembra utilizando un pulverizador manual que facilitó la distribución del inóculo sobre las plántulas. Las bandejas inoculadas se mantuvieron durante 48 h en cámara húmeda, bajo condiciones de 100 % de humedad relativa y 23 °C. Luego de ese período, las bandejas fueron regresadas al invernáculo para permitir el desarrollo de la enfermedad durante 10 días (Figura 13). Al cabo de ese período, se estimó el porcentaje de supervivencia de plántulas relacionando el número de sobrevivientes y el número inicial en cada bandeja. Para determinar el número inicial de plántulas se tomó como válido el conteo registrado a los 10 días de la siembra. La evaluación se realizó según lo establecido por O´Neill (1991).
Figura 13. Protocolo de selección para resistencia a C. trifolli: a) cultivo del hongo y recuento de esporas; b) pulverización de plántulas con suspensión de esporas; c) cámara húmeda (24-72 h) para favorecer la infección; d) identificación de genotipos resistentes.
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