Estas familias parásitas de insectos se caracterizan por su alta virulencia y amplio rango de hospederos , que incluyen la mayoría de los órdenes y familias de insectos; y porque pueden propagarse masivamente . Estos nematodos además matan a su hospedero de veinticuatro a cuarenta y ocho horas después de ocurrida la infec- ción , por esto son atractivos desde el punto de vista biológico y comercial (Poinar, 1990).
Actualmente existen nueve especies de Steinernema y tres de Heterorhabditis colectadas en diferentes áreas geográficas (Poinar, 1990). El ciclo biológico de ambos géneros es muy similar, se inicia con el tercer estado juvenil, que se caracteriza por retener la cutícula del segundo estado juvenil, lo cual le permite adaptarse y perma- necer en el medio ambiente durante largo tiempo. Estas formas juveniles tienen la tendencia a buscar su hospedero y una vez que se contactan con éste penetran por medio de las aberturas naturales (boca, espiráculos, ano) o a través de la cutícula.
Una vez que el nematodo entra en el hemocele del insecto, éste libera la bacteria , la cual empieza a multiplicarse y causa septicemia que mata al hospedero. La bacteria la consumen y digieren los nematodos (véase figura 4.72).
Los nematodos maduran y fecundan, si la población de Xenorhabdus está bien establecida se desarrolla la primera generación de juveniles. Esta primera generación madura y culmina en la segunda generación de adultos. La progenie de esta segunda generación de adultos se convierte en dauer juvenile s. Si existe suficiente humedad, los dauer juveniles dejan el hospedero y van en busca de otro hospedero.
Una de las principales diferencias en el desarrollo entre Steinernema y Heteror- habditis la constituye que en Steinernema existe diferenciación de hembras y machos, pero nunca formas hermafroditas; mientras que en Heterorhabditis la primera gene- ración de adultos es hermafrodita y la segunda posee hembras y machos.
La bacteria asociada con heterorhabditidos (X. luminescens ) tiene similitud a X. nematophilus , simbionte de Steinernema , pero los insectos infectados toman color rojo ladrillo en lugar del café ocre, característico de insectos infectados con X. nematophilis y luminan en la oscuridad (Poinar et al., 1980).
Los nematodos entomopatógenos forman un complejo nematodo-bacteria (véase tabla 4.14). Los nematodos actúan como una “inyección biológica” para su compañera bacterial, la relación entre estos dos organismos es un clásico mutualismo . El nematodo puede crecer y reproducirse dentro de su huésped según las condicio-
nes establecidas por la bac- teria. La bacteria también contribuye con proteínas anti-inmunes que ayudan al nematodo a burlar las defensas del organismo del hospedero , y con antimi- crobianos que impiden la colonización del cadáver por parte de otros micro- organismos competidores . Adicionalmente, la bacteria carece de poderes invasivos y depende por completo del nematodo para ingresar dentro de su huésped.
La dispersión de Stei- nernema y Heterorhabditis depende de la textura del suelo y de la presencia de su hospedero . En suelos arcillosos el movimiento de los nematodos es limi- tado (Molyneux y Bedding, 1984).
Figura 4.72 Ciclo de vida de los nematodos entomopatógenos Diagrama: A. Hara
La humedad y temperatura del sustrato tienen un efecto importante. Condi- ciones de baja humedad y baja temperatura inhiben el movimiento de los nemato- dos . El exceso de agua también reduce el movimiento del nematodo por la asfixia (Kaya, 1990).
Estos nematodos favorecen su dispersión ya que responden positivamente a seriales físcos y químicos que producen los insectos (CO2, gradientes químicos, etc.) (Pye y Burman, 1981).
Los hospederos que infectan estos nematodos viven por 48 horas, y sirven como medio para que los nematodos se dispersen en el suelo. Las larvas infectadas se mueven lateralmente o hacia abajo en el suelo, y los adultos infectivos pueden volar varios metros antes de morir y establecer un nuevo foco de infección (Molyneux et al., 1983; Timper et al.; 1988).
Para sobrevivir o persistir en el suelo, su reservorio natural, estos nematodos entomopatógenos han desarrollado tres estrategias de comportamiento : agrupación, inactividad y antihidrobiosis (Ishibashi y Kondo, 1990; Womersley, 1990), estrate- gias que tienen un valor protector. Además, para persistir necesitan reproducirse o reciclarse dentro de un hospedero .
Estas familias se usan comercialmente como agentes de control porque poseen los siguientes atributos :
• Un amplio rango de hospederos .
• La habilidad de matar a su hospedero en 48 horas. • La capacidad de crecer en un medio artificial.
• Un estado infectivo durable que puede guardarse por tiempo variado. • Una ausencia de desarrollo de resistencia por el hospedero .
• Aparentemente seguro al ambiente.
Los nematodos entomopatógenos se formulan y aplican en estados juveniles infectivos, la única etapa de vida libre y tolerante al ambiente. Las dimensiones de estos juveniles van desde 0,4 a 1,1 mm de longitud, por eso se observan con lupa o microscopio . Cuando son molestados se mueven rápidamente y cuando se encuen- tran en medios líquidos toman una forma de jota (S. carpocapsae y S. scapterisci ). Las
Tabla 4.14 Especies de Steinernema y Heterorhabditis y su bacteria mutualista
Nematodo Especie de bacteria asociada Steinernema carpocapsae Xenorhabdus nematophilus
S. feltiae (bibionis) X. bovienii S. araussei X. bovienii S. affi nis X. bovienii S. intermedia X. bovienii S. glaseri X. poinari Especie no identifi cada X. beddingii S. rara Xenorhabdus sp.
S. anumali Xenorhabdus sp.
bajas temperaturas y niveles de oxígeno pueden inhibir su movimiento, incluso si son especies muy activas como S. glaseri y H. bacteriophaga. Los nematodos de buena calidad tienden a poseer altos niveles de lípidos que proveen una apariencia densa, mientras que los nematodos transparentes son activos pero poseen menos virulencia (véase figura 4.73).
Los nematodos entomopatógenos de los géneros Steinernema y Heterorhabditis habitan exclusivamente en el suelo. Se han aislado de una gran diversidad de há-
bitats como: cultivos, bosques, pastizales , desiertos y playas.
Debido a que las bacterias simbióticas matan a los insectos tan rápidamente, no existe una íntima re- lación entre el huésped y el parásito. En consecuencia, los nematodos entomopatógenos son letales para un amplio rango de hospederos . En la tabla 4.15 pueden observarse los huéspedes de los nematodos entomo- patógenos en diferentes cultivos.
Los nematodos entomopatógenos son marcada- mente versátiles y resultan muy útiles para controlar muchas especies de insectos plaga del suelo , sin embar- go, su uso es todavía restringido. Como otros agentes de control biológico , los nematodos son susceptibles a muchos factores adversos de los seres vivos que re- quieren de condiciones específicas para ser efectivos. La deshidratación y los rayos UV eliminan rápidamente a los nematodos .
Características de algunas especies de nematodos entomopatógenos
Steinernema carpocapsae .
El nematodo más estudiado, disponible y versátil de todos los entomopátogenos. Entre los atributos más importantes se incluyen: fácil de producir de forma masiva y habilidad de formularse en un estado parcialmente disecado, lo cual extiende su periodo de duración a varios meses. Tiene particular efectividad contra las larvas de lepidópteros . Esta especie sorprende o embosca a su huésped, se para sobre su cola y ataca al hospedero que pasa; por lo que S. carpocapsae es más efectivo contra los insectos de gran movilidad. Poseen una alta sensibilidad al dióxido carbono , y una vez que localiza el huésped, ingresa por sus espiráculos. Es más efectivo a temperaturas entre 22 y 28°C.Steinernema feltiae.
Ataca especialmente a dípteros en estado inmaduro . Este nematodo resulta aun infectivo a temperaturas del suelo menores a 10°C. S. feltiae ofrece menos estabilidad que otros steinernemátidos .Steinernema glaseri.
Nematodo entomopatógeno de mayor tamaño, posee el doble en longitud y ocho veces más volumen que los juveniles infectivos de S. carpocapsae . Ataca principalmente larvas de coleópteros , en particular Scarábeidae. Este entomopatógeno se encuentra mejor adaptado para parasitar huéspedes de movimiento lento y que residen dentro del suelo. Debido a su mayor tamaño, enFigura 4.73 Forma sigmoidea que toman los nematodos ento- mopatógenos
relación a las otras especies, su producción es significativamente más costosa . S. glaseri tiene la tendencia de “perder” a su simbionte bacterial y no tolera la deshidratación, por eso no resulta apto para formulaciones disecadas.
Steinernema kushidai .
Únicamente se ha aislado en Japón y se conoce que parasita sólo larvas de Scarabaeidae . Actualmente se realizan ensayos de campo y laboratorio para determinar la eficacia de este nematodo como agente de control biológico , al parecer, con resultados prometedores.Steinernema riobravis .
Este nematodo sólo se ha aislado en el valle de Río Grande en Texas. Su rango de hospederos es muy amplio , ataca a varios órdenes de insectos plaga . Algunos ensayos demuestran marcada eficacia contra varias especies grillos y el gusano del maíz Heliothis zea (Lepidoptera : Noctuidae ). En Florida se tratan 27.000 ha de cítricos anualmente para el control del gorgojo de la raíz de éstos, Diaprepes abbreviatus (Coleoptera : Curculionidae), con excelentes resultados. Este nematodo responde mejor cuando las temperaturas del suelo alcanzan 35°C.Steinernema scapterisci .
El único nematodo entomopatógeno usado en un programa de control biológico clásico . S. scapterisci se aisló por primera vez en Uruguay y se liberó en Florida en 1985 para controlar la plaga exótica , Scapteriscus acletus (Orthoptera : Gryllotalpidae). Este nematodo es específico para los adultos de la plaga. Se encuentra disponible en el comercio desde 1993.Heterorhabditis bacteriophora .
Se encuentra entre los nematodos entomopa- tógenos más importantes. Posee una considerable versatilidad, ataca principalmente larvas de coleópteros y lepidópteros . Es un nematodo de temperatura templada , su eficacia disminuye cuando la temperatura del suelo se ubica por debajo de 20°C. Lamentablemente, es un nematodo poco estable, es decir, los juveniles infectivos persisten sólo unos pocos días luego de su aplicación.Tabla 4.15 Principales hospederos de nematodos entomopatógenos
Cultivo Hospedero Nematodo entomopatógeno
Alcachofa Platyptilia carduidactyla S. carpocapsae
Bayas Gorgojos de las raíces H. bacteriophora
Cítricos Gorgojos de las raíces S. riobravis
Arándanos Gorgojos de las raíces H. bacteriophora, S. carpocapsae Chrysoteuchia topiaria S. carpocapsae
Champiñones Dípteros de la familia Sciaridae S. feltiae
Ornamentales Gorgojos de las raíces H. bacteriophora, H. megidis
Taladradores S. carpocapsae, H. bacteriophora
Dípteros de las familias Fungivoridae y Sciaridae
S. feltiae
Pastos Escarabajos H. bacteriophora
Grillos S. riobravis, S. scapterisci
Gorgojos H. bacteriophora, S. carpocapsae
Heterorhabditis megidis.
Se aisló por primera vez en Ohio, Estados Unidos. Este nematodo se comercializa en Europa para el control del gorgojo Otiorhynchus sulcatus (Coleoptera : curculionidae) y otros insectos del suelo. Es de mayor tamaño que H. bacteriophora y se caracteriza por su inestabilidad dentro de este grupo de nematodos entomopatógenos .Rhabditidae
Phasmarhabditis hermaphrodita
(Rhabditida : Rhabditidae ). Nematodo parási- to de los caracoles y babosas , se comercializó recientemente en Inglaterra como un molusquicida biológico . Los métodos de producción y formulación para este nematodo son similares a los que se usan para los nematodos entomopatógenos . Estos nematodos se venden en estado juvenil infectivo (larva dauer), miden aproxi- madamente 1 mm de longitud, por eso se observan a simple vista. Se encuentran en lugares donde abundan los caracoles y las babosas. Se han aislado de pastizales y cultivos de trigo . Los juveniles (larvas dauer ) de P. hermaphrodita se movilizan por el suelo en busca de su huésped, una vez lo localizan, lo infectan ingresando por los orificios naturales. Dentro del cuerpo del huésped, la larva dauer se desarrolla, se convierte en hermafrodita y se reproduce dando origen a una nueva generación. Durante este tiempo, el huésped desarrolla una hinchazón característica en la re- gión del manto. El hospedero muere usualmente en un periodo de siete a veintiún días, pero reduce de forma significativa su actividad alimenticia desde el inicio de la infección. En ensayos de laboratorio, una dosis de nematodos equivalente a la mitad de la recomendada en el campo inhibió la alimentación de las babosas en 90% en cuatro días de exposición. Una vez que el huésped muere, los nematodos se dispersan en el cadáver y se alimentan de él. Cuando la fuente de alimento se acaba, los nematodos forman de nuevo larvas dauer, las cuales empiezan a buscar nuevos hospederos. P. hermaphrodita se alimenta de bacterias . Al contrario de otros nematodos entomopatógenos , no poseen relaciones simbióticas específicas con bac- terias. P. hermaphrodita infecta y mata a varias especies de babosas y caracoles. Entre las especies de babosas se encuentran: Deroceras reticulatum , Deroceras caruanae , Arion ater , Arion intermedius , Arion distinctus , Arion silvaticus , Tandonia budapestensis , Tandonia sowerbyi . Entre las especies de caracoles están: Monacha cantiana , Lymnaea stagnalis , Helix aspersa , Theba pisana , Cernuella virgata , Cochlicella acuta .P. hermaphrodita se ha usado en varios ensayos de campo en cultivos de lechuga , fresas , papa y trigo en Inglaterra, Francia, Holanda y Suiza. Aplicado en dosis de tres billones por hectárea, actúa de una forma equivalente a los pellets de metio- carb , un estándar químico. Debido a la rápida inhibición de la alimentación que P. hermaphrodita ocasiona en su huésped, puede aplicarse al mismo tiempo que los molusquicidas químicos .
Las estrategias de conservación para los nematodos entomopatógenos se han desarrollado poco. Se recomienda no realizar riegos luego de la aplicación, ya que esto lavaría a los juveniles en el suelo, llevándolos hacia partes más profundas. Las poblaciones nativas son significativamente prevalentes.
Los juveniles infectivos son compatibles con casi todos los agroquímicos bajo condiciones de campo. Heterorhabditis bacteriophora es el nematodo más sensible al estrés físico , aunque fue tolerante a inmersiones de tres días en 58 de 65 fungicidas, herbicidas , insecticidas y nematicidas.
Estos nematodos pueden usarse en mezclas con la mayoría de fertilizantes y agroquímicos, siempre y cuando la exposición sea breve. Debe evitarse el uso de los insecticidas bendiocarb , clorpirifos , etoprop e isazofos ; los fungicidas anilazina , fenarimol , clorados; los herbicidas 2,4-D y triclopir , y el nematicida fenamifos .
De las treinta especies de nematodos steinernemátidos y heterorhabditicos identificadas hasta hoy, se encuentran disponibles comercialmente siete especies. Se recomienda aplicar un billón de nematodos por acre (250.000 por m²) para controlar la mayoría de insectos plaga del suelo.
Producción masiva de nematodos
La utilización de cualquier agente de control biológico depende de su disponibilidad en suficientes cantidades a un costo aceptable. Los steinernemátidos y heterorhab- dítidos han sido producidos in vivo e in vitro .
Los nematodos entomopatógenos pueden propagarse in vivo , proceso en el que se utiliza al insecto como un pequeño reactor biológico. El principal insecto utilizado para este propósito ha sido la palomilla de la cera Galleria mellonella (Lepidoptera : Pyralidae ). Larvas totalmente desarrolladas producen alrededor de 200.000 formas juveniles . El costo de producción es alto y el método presenta inconsistencia por la contaminación que puede ocurrir con otros microorganismos.
El cultivo in vitro de estos nematodos se ha desarrollado a través del tiempo. Dutky (1964) recomendó el medio basado en peptona-glucosa-agar e hígado de puer- co. Más tarde Hause et al. (1965) recomendaron el uso de una fase sólida preparada a base de croquetas para perro, que completaron con una fase líquida (Hassen et al., 1968), favorable para incrementar la producción de nematodos.
Bedding (1984) desarrolló un método en el que se lograba escalar la produc- ción de 1.000.000 a 40.000.000 nematodos por frasco, mediante la utilización de hule espuma en pequeños fragmentos embebidos en vísceras de pollo previamente molidas. Este método en general se adopta al inicio de un programa de producción comercial .
Buecher y Popiel (1989) describieron un medio líquido monoxénico, con el cual se ha obtenido el desarrollo total de S. carpocapsae . La mayor experiencia en el cultivo en fase sólida de cultivos monoxénicos se indica por la abundancia de literatura que se generó a finales del siglo XX además de la publicación de dos patentes internacio-
nales que intentan el cultivo monoxénico en fermentadores (Friedman, 1990). El desarrollo de estos procesos de escalamiento para la producción de nema- todos ha sido notorio. Steinernema carpocapsae se ha producido consistentemente y en forma efectiva en fermentadores de 15.000 a 80.000 con una capacidad de producción tan alta como 100.000 infectivos/ml en un medio que contiene harina de soya , extracto de levadura, aceite de maíz y yemas de huevo (Friedman, 1990;
Georgia, 1990). El costo de los productos se ha reducido comparado con el de años anteriores, por el progreso en fermentaciones líquidas . El género Heterorhabditis no se ha logrado producir en forma eficiente en fermentadores. Estos nematodos se producen más eficientemente en medios de cultivo sólidos (Hominick y Reid, 1990). Kaya (1993) provee información sobre cómo criar y usar estos nematodos como agentes de control biológico .
El desarrollo de formulaciones estables y la adopción de un programa de control de calidad por la industria han asegurado la aplicación de productos estandarizados y viables. Uno de los elementos más importantes en la comercialización de nematodos es su compatibilidad con el equipo que existe para la aplicación de agroquímicos (Georgis, 1990), o sea que pueden aplicarse con el equipo común de aspersión tanto terrestre como aérea. Otros métodos que se utilizan para la aplicación de nematodos contra los insectos plaga son de infección (larvas de Scarabaeidae , Curculionidae y Diabrotica spp. (Coleoptera Chrysomelidae); cebos (Agrotis ipsilon (Lepidoptera : Noctuidae ), Scapteriscus vicinus (Orthoptera : Gryllotalpidae) (Georgis, 1990) y cáp- sulas de alginato (Kaya, 1993). Este tipo de estrategias de aplicación requiere menor cantidad de nematodos para lograr un control efectivo ya que éstos proveen mejor protección contra las condiciones extremas del medio ambiente .
Pruebas de campo con nematodos entomopatógenos
La utilización de nematodos entomopatógenos se inició contra plagas del suelo en 1930, cuando se probó S. glaseri para el control biológico del escarabajo japonés Popillia japonica . En contraste S. carpocapsae , aislado en 1950, se utilizó principal- mente como control biológico de insectos foliares (Kaya, 1993). Se obtuvo excelente control contra insectos presentes en ambientes húmedos y protegidos, pero ocurrie- ron muchas fallas contra insectos desfoliadores. Durante la década de los ochenta las aplicaciones foliares probaron ser ineficientes debido a la rápida desecación e inactivación por la luz solar, lo cual propició un cambio en la utilización de estos nematodos para el control de insectos del suelo , su hábitat natural . Welch y Briand (1961) reportaron que la aplicación de nematodos contra Pieris rapae (Lepidoptera : Pieridae) resultó en 73 a 77% de mortalidad comparada con 84% de mortalidad que causa el tratamiento químico . Pese a estos resultados, la observación de plantas tratadas demostró que no se logró protección del follaje. Esto se debe a que los nematodos sobreviven en este medio por algunas horas. Otros intentos de control de insectos desfoliadores enfatizan la importancia de la humedad para obtener un control efectivo de esas plagas.
La rápida desecación de los nematodos aplicados en el follaje resulta ser una limitante muy importante, y el desarrollo de antidesecantes y protectores de luz ultravioleta se vuelve indispensable para incrementar la actividad de los nematodos y la mortalidad de insectos .
El suelo ofrece un excelente sitio para que ocurra la interacción entre nematodos e insectos; más de 90% de los insectos pasan parte de su vida en el suelo, es éste el reservorio natural de los nematodos steinernemátidos y heterorhabditidos .
Las pruebas de campo contra larvas de Scarabaeidae se han concentrado en el uso de S. carpocapsae y Heterorhabditis sp. Diferentes razas de estos dos nematodos se han probado y demuestran que las especies de Heterorhabditis son superiores contra plagas del suelo debido a su actividad, éstos se mueven verticalmente y alcanzan cierta profundidad del suelo y además pueden penetrar las membranas intersegmentales del insecto. Sin embargo, algunas pruebas de campo realizadas en Estados Unidos con H. bacteriophora han sido poco exitosas. Estos resultados negativos reflejan dife- rencias entre razas e influencia de factores ambientales adversos .
Las bajas temperaturas en el suelo son un factor que restringe la actividad de los nematodos . Un control de 88% se obtiene cuando la temperatura fluctúa entre 21-20oC (Klein, 1990). La humedad del suelo también constituye un factor crítico para la sobrevivencia y el movimiento de los nematodos; Jackson et al. (1983) de- mostraron que los nematodos aplicados durante la lluvia o después de irrigar se establecieron en comparación con los aplicados en condiciones secas.