Conditional Random Fields

Diferentes autores han aplicado la titulación a punto final para determinar la actividad enzimática en lipasas vegetales (de Sousa et al. 2010; Aguieiras et al. 2014). Es de esperar que,

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luego de la reacción de hidrólisis, el pH final del medio de reacción sea menor que el pH inicial. Por este motivo, este método se basó en llevar el pH de la mezcla final de reacción hasta un pH superior (ej. 11) elegido como punto final. Para ello se utilizó una solución de NaOH de molaridad conocida y un pH˗metro como instrumento de medición.

Blanco de reacción: De todos los blancos empleados en las diferentes metodologías, los sistemas descriptos a continuación fueron los de mayor complejidad. Dos sistemas de blancos diferentes se emplearon con el objetivo de encontrar aquel que fuera más representativo de la muestra a analizar. Una vez más, el objetivo fue encontrar el conjunto de blancos adecuados para diferenciar los AGL producidos en la hidrólisis catalítica de aquellos que generados por la degradación o solubilización natural de algún componente presente en el medio de reacción (ej. catalizador, sustrato). En cada sistema se emplearon tres blancos de reacción diferentes para cuantificar la acción lipásica de una única muestra hidrolizada. Los detalles se describen a continuación:

Sistema A: este sistema utilizó la ausencia de aceite en el medio para generar un blanco de reacción que consideró la incubación del polvo enzimático dentro del medio de reacción sin la disponibilidad de sustrato.

El diagrama de la Figura 2.4 permite apreciar de forma simplificada la metodología del blanco que se describe a continuación. Como se mencionó anteriormente, se utilizaron tres blancos para el análisis de cada muestra hidrolizada: un blanco “instantáneo” de la muestra (BMIns), un blanco sin sustrato incubado (BSSInc) y un blanco sin sustrato

“instantáneo” (BIIns). El blanco BSSInc se realizó exactamente igual que la muestra

hidrolizada con la diferencia de que no se adicionó sustrato y se incubó bajo las mismas condiciones que la muestra. Por esta razón el consumo de NaOH del BSSInc fue

cuantificado mediante los pasos 2-6 del procedimiento experimental (al igual que la muestra hidrolizada). Esto permitió evaluar los cambios de pH generados por la solubilización de algún componente del catalizador y/o por la hidrólisis del aceite endógeno del mismo (que pudo haber persistido en el polvo luego del proceso de extracción).

Por otro lado, se utilizó la palabra “instantáneo” para denominar a aquellos blancos en donde el solvente orgánico (Figura 2.3) fue adicionado antes que el catalizador para evitar que pueda desarrollarse la reacción de hidrólisis (equivalente a tiempo de reacción cero). En primer lugar, BMIns fue el blanco que permitió definir el pH final hasta el cual se

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lugar, el blanco BSSIns fue idéntico al BMIns con la diferencia deque no se adicionó sustrato

en el medio de reacción. Éste último blanco es el que se utilizó para definir el pH final empleado en el paso 4 del procedimiento experimental al titural el BSSInc (paso 6).

Figura 2.4 Representación gráfica del sistema A de blancos de reacción utilizado en el método de titulación a punto final empleando pH metro. MH: muestra hidrolizada, BMIns: blanco de muestra “instantáneo”, BSSInc: blanco sin sustrato

incubado, BSSIns: blanco sin sustrato “instantáneo”. Los componentes

mencionados en cada rectángulo son ilustrativos; la composición completa de los diferentes medios de reacción fue detallada para cada caso particular.

La ventaja que presenta este sistema es que permite diferenciar el aporte de acidez de la reacción de hidrólisis respecto de la producida por otros efectos (solubilización de componentes del catalizador o hidrólisis de aceite endógeno a lo largo de la incubación). También permite realizar varias reacciones en simultáneo y se pueden emplear tiempos de reacción largos (ej. 24 h). Como desventaja se puede mencionar que no permite identificar si existe deterioro del aceite en el sistema de reacción a lo largo de la incubación. Tampoco admite control de pH, el cual podría llegar a variar a lo largo del tiempo si hay una elevada concentración de AGL.

Sistema B: este sistema utilizó la inactivación del catalizador mediante temperatura. Existe bibliografía que indica que las lipasas vegetales presentan su temperatura óptima entre 30 y 55 °C, presentando mayor resistencia a la inactivación térmica cuando no

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reportado que algunas de ellas alcanzan la inactivación completa a los 55 °C (Cavalcanti et al. 2007; Pierozan et al. 2011). Por esta razón se eligió una temperatura de 100 °C que se mantuvo durante 1 h para inactivar algunos de los catalizadores empleados.

El diagrama de la Figura 2.5 permite simplificar la metodología del blanco que se describe a continuación. Nuevamente se utilizaron tres blancos para evaluar cada muestra hidrolizada: un blanco “instantáneo” de la muestra (BMIns), un blanco inactivado

incubado (BIInc) y un blanco inactivado “instantáneo” (BIIns). El blanco BIInc fue realizado

exactamente igual que la muestra hidrolizada salvo que se usó catalizador inactivado, siendo éste incubado bajo las mismas condiciones que la muestra. Por esta razón el consumo de NaOH del BIInc se cuantificó mediante los pasos 2-6 del procedimiento

experimental (al igual que la muestra hidrolizada). El objetivo principal fue obtener un blanco que contemple la posible degradación del aceite y/o la solubilización de componentes (y aceite endógeno) del catalizador, así como también la posible interacción entre ambos fenómenos o la hidrólisis de aceite endógeno del propio catalizador, particularmente en el caso de los extractos no desgrasados.

Por otro lado, se utilizó la palabra “instantáneo” bajo el mismo concepto que en el sistema A. En primer lugar, BMIns fue el blanco que permitió obtener el pH final hasta el

cual se tituló a la muestra hidrolizada (paso 4 del procedimiento experimental). En segundo lugar, el blanco BIIns fue idéntico al BMIns con la diferencia deque se utilizó el

catalizador inactivado y se utilizó para definir el pH final empleado en el paso 4 del procedimiento experimental cuando al titular el BIInc (paso 6).

La ventaja de esta metodología es que permite un blanco incubado que incorpora sustrato y catalizador al mismo tiempo. También permite realizar varias reacciones en simultáneo y se pueden emplear tiempos de reacción largos (ej. 24 h). La desventaja es que no se puede asegurar una inactivación total de catalizador y que se desconocen los efectos físicos o químicos del proceso de inactivación sobre el catalizador pudiendo no ser comparable con el extracto sin inactivar. Tampoco admite control de pH, el cual puede variar a lo largo del tiempo si hay una elevada concentración de AGL.

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Figura 2.5 Representación gráfica del sistema B de blancos de reacción utilizado en el método de titulación a punto final empleando pH metro. MH: muestra hidrolizada, BMIns: blanco de muestra “instantáneo”, BIInc: blanco inactivado

incubado, BIIns: blanco inactivado “instantáneo”. Los componentes mencionados

en cada rectángulo son ilustrativos; la composición completa de los diferentes medios de reacción fue detallada para cada caso particular.

Procedimiento experimental

1- Encender el pH˗metro y calibrar el electrodo en pH 4 y pH 7. 2- Colocar la mezcla incógnita en un vaso de precipitado de 25 mL. 3- Colocar el electrodo de pH, medir el pH y registrar.

4- Utilizar una bureta para adicionar y cuantificar la solución de NaOH hasta alcanzar el pH determinado por el blanco de reacción correspondiente (sistema A o sistema B) y registrar.

5- Calcular los micromoles de NaOH consumidos.

6- Repetir pasos 2-5 para blanco sin aceite (sistema A) o blanco inactivado (sistema B). 7- Restar los micromoles de NaOH del blanco a aquella de la muestra hidrolizada.

8- Utilizar los micromoles de NaOH obtenidos en el paso 7 para calcular las diferentes expresiones de interés (Ej. µmolAGL/gAceitegExtracto o µmolAGL/gExtracto).