la pre-exposición en ratas pre y post-destetadas.
Como se describió en la introducción, los NMDAr son canales iónicos
permeables al Ca2+ que están formados por 4 subunidades que, según la combinación
de las mismas, le confieren al canal propiedades biofísicas particulares (Cull-Candy y Leszkiewicz, 2004). Las subunidades NR2A y NR2B son las que predominan en el cerebro anterior, y presentan particularidades que las diferencian entre sí, no sólo por
166
su expresión diferencial en el desarrollo y en las regiones cerebrales, sino también por su localización subcelular y por las capacidades de interactuar con distintos complejos de proteínas y así desencadenar cascadas de señalización que acercan a cada una de ellas a procesos diferenciales en las que se encuentran involucradas (Yashiro et al., 2008). Las características diferenciales en la sensibilidad a moduladores endógenos, permeabilidad o bloqueo de los canales, cinética e interacción con proteínas intracelulares hacen que los NMDAr conformen una familia que presenta un amplio rango funcional. Se han relacionado particularmente a los receptores que contienen subunidades del tipo NR2B en procesos de aprendizaje y memoria (Berberich et al., 2005a, 2007; Oh-Nishi et al., 2009; Müller et al., 2013; Chen et al., 2014). En este sentido, estudios previos han evidenciado que, tanto en ratones knockdown de NR2B, o debido a la disminución de la fosforilación de tirosinas de NR2B (aunque sea de manera parcial) se observa un impedimento en la ocurrencia de LTP hipocampal o cortical, y en consecuencia en el desempeño en el aprendizaje (Clayton et al., 2002; Takehara et al., 2004; Zhao et al., 2005; Cravens et al., 2006; Gardoni et al., 2009b), mientras que la sobreexpresión transgénica o la disminución de la degradación de NR2B reflejan un aumento del LTP en el HPC y una mejora en el aprendizaje (Tang et al., 1999; Hawasli y Bibb, 2007).
Para inducir mecanismos de LTD o LTP dependiente de los NMDAr, las vías de señalización que se desencadenan deben estar acopladas a las subunidades que forman al receptor, por lo que las proteínas de interacción con las mismas son determinantes claves de la dirección de la plasticidad sináptica (Carlisle y Kennedy, 2005). NR2B se une a compañeros únicos, por ejemplo, se une e interactúa con Ras-
GRF1 (del inglés,Ras-guanine nucleotide-releasing factor 1) o con RasGAP (Ras GTPase
activating protein), a través de la proteína asociada a la sinapsis 102 (SAP102). Esta asociación única afecta la inducción de plasticidad (Zhu et al., 2002). Uno de los sustratos a los que se une específicamente NR2B es CaMKII, que se encuentra ampliamente expresada en las sinapsis, y se conoce su acción en la generación de LTP (Lisman et al., 2002). Esta proteína CaMKII se une con mucha afinidad a NR2B y con baja afinidad a NR2A. El Ca2+ que ingresa a la célula postsináptica a través de los
167
complejo que interactúa y activa a CaMKII, que se une fuertemente a NR2B, permitiéndole que se mantenga en estado activado aún luego de la disociación del
complejo Ca2+/calmodulina. Esta asociación de NR2B con CaMKII es requerida para la
inducción de LTP (Barria y Malinow, 2005). Por otra parte, se ha establecido que tanto NR2A como NR2B contienen un motivo de unión PDZ en su extremo C-terminal, que mantiene a las subunidades en la densidad postsináptica a través de la unión con proteínas de anclaje de la familia de las MAGUKs, como la PSD-95 o SAP102. Interesantemente, la unión a PDZ es requerida para la localización sináptica de NR2B pero no de NR2A (Lin et al., 2004; Prybylowski et al., 2005). Ambas subunidades NR2 contienen señales endocíticas en su extremo C-terminal, siendo el motivo YEKL en NR2B el que se une a la proteína adaptadora de clatrina, AP2, para mediar la endocitosis mediada por clatrina. Cuando se fosforila en NR2B el motivo YEKL en la tirosina tyr-1472 (Y1472), por la acción de la proteína quinasa Fyn (de la familia de las Src), la misma se protege de la unión a AP2 y, por lo tanto, de su endocitosis, siendo este un mecanismo regulatorio de la localización subcelular de NR2B y de su disponibilidad sináptica (Lavezzari et al., 2003; Rodrigues et al., 2001; Zhang et al., 2008a). Además, se ha reportado que la fosforilación de la subunidad NR2B en Y1472, se encuentra aumentada después de la inducción de LTP en el hipocampo, y se propone que Y1472 es un sitio de fosforilación principal que participa en la modulación de la plasticidad sináptica del HPC (Nakazawa et al., 2001). En un procedimiento de condicionamiento de miedo Pavloviano, se observó un aumento de Y1472-NR2B luego de la asociación entre el contexto y el condicionamiento, lo cual no fue observado en respuesta a la descarga inmediata, lo que indicaría que no hay cambios en la dinámica de los NMDAr en el déficit de la descarga inmediata (Isosaka et al., 2008). Estos datos demuestran la importancia de la subunidad NR2B en la actividad mediada por los NMDAr, y resaltan el sitio de fosforilación Y1472 como candidato de la dinámica de la
subunidad NR2B durante la adquisición de aprendizaje contextual.
Por otra parte, se ha establecido que el complejo Cdk5/p35 cumple un papel importante en la regulación de las subunidades del receptor NMDA (Sato et al., 2008; Morabito et al., 2004; Hawasli y Bibb, 2007; Hawasli et al., 2007; Zhang et al., 2013). El complejo Cdk5/p35 es un importante regulador de la función sináptica y de la
168
señalización glutamatérgica (Dhavan y Tsai, 2001; Angelo et al., 2006; Lai et al., 2012b). Ha sido demostrado que Cdk5 facilita la degradación de la subunidad NR2B mediada por clatrina (Hawasli et al., 2009) y, además, fosforila directamente al extremo N- terminal de la PSD-95 facilitando la internalización de la subunidad NR2B (Morabito et al., 2004; Zhang et al., 2008b).
La posibilidad que nos presentaron los hallazgos de la serie experimental 2, a través de los resultados obtenidos por la inhibición de los NMDAr durante la fase de pre-exposición y la consecuente provocación de la modificación del patrón
comportamental de sujetos tanto de PN23 como de PN17, se encuentra reforzada por
los resultados obtenidos en la serie experimental 3. La misma fue diseñada para evaluar la dinámica de los NMDAr, específicamente de la subunidad NR2B, luego de la exposición a un contexto novedoso desconocido. Este abordaje se realizó a través de la evaluación de su expresión en sinaptosomas de HPCd, a distintos tiempos posteriores a la finalización de la pre-exposición, tanto en los sujetos pre como post-destetados. Es importante destacar que la pre-exposición al contexto de entrenamiento se realizó en una única sesión de 10 minutos de libre exploración, y luego de su finalización se analizaron los niveles de expresión de NR2B, NR2BY1472, PSD-95, Cdk5 y p35 a distintos tiempos (desde minuto 0 a 70 post pre-exposición) en comparación con sujetos no pre-expuestos que fueron sacrificados sin ninguna manipulación.
Los resultados de esta serie revelaron una actividad temporal dinámica del estado fosforilado de NR2B, en el sitio específico Y1472, que está funcionalmente relacionado con la determinación de la localización subcelular del receptor, y en consecuencia su disponibilidad para la sinapsis.
Los datos obtenidos muestran un aumento en la expresión de este estado fosforilado de NR2B (y no de la subunidad NR2B total) posterior a un tratamiento de pre-exposición en un contexto nuevo, el cual no fue detectado en el grupo no pre-
expuesto. Este resultado fue encontrado en PN23 y, de manera interesante, en PN17.
En ambas edades, la relación NR2BY1472 / NR2B muestra un aumento transiente luego de la adquisición de la información de contexto. Lo novedoso de este hallazgo es que es la primera vez que se ha detectado en ratas pre-destetadas, un resultado que
169
va en contra de la hipótesis de que el hipocampo dorsal no es funcional durante esta etapa ontogenética. Nuevamente, este resultado refuerza la idea de que los mecanismos a través de los cuales los sujetos de las edades estudiadas adquieren el aprendizaje de contexto parecen ser similares, e involucran a la subunidad candidata, según la literatura, como mediadora de esta tarea en adultos.
Por otra parte, no encontramos diferencias en sinaptosomas de HPCd en los niveles de expresión de las proteínas regulatorias propuestas: Cdk5, p35 ni PSD-95, en ninguna de las edades. Sin embargo, no necesariamente la ausencia de diferencias en la expresión total de las mismas reflejaría que estos complejos de proteínas no interactúan entre sí durante la adquisición de aprendizaje de contexto. Se desprende de este resultado la necesidad de realizar un análisis más profundo para evaluar la interacción entre los actores propuestos en la regulación de la localización de NR2B, como por ejemplo, a través de metodologías de biotinilación de proteínas de membrana, o realización de ensayos de coinmunoprecipitación. A modo preliminar, realizamos un ensayo de inmunoprecipitación de la proteína PSD-95 en sinaptosomas de HPCd de sujetos pre-expuestos y no pre-expuestos al contexto, y estudiamos la relación entre la expresión de esta proteína con Cdk5. En la sección 3 se encuentra este resultado preliminar, en donde observamos que la relación Cdk5/PSD-95 es mayor en los sujetos no pre-expuestos en comparación con los sujetos no pre-expuestos, lo que nos sugiere que podría existir una relación indirecta, e inversa, entre Cdk5 y NR2B, a través de PSD-95, en el proceso de adquisición de aprendizaje contextual, con respecto a su participación y contribución, mediante su localización subcelular, lo cual fue propuesto como hipótesis de esta tesis.
Entre los mecanismos que proponen a Cdk5 como proteína que participa en la regulación de la transmisión sináptica a través de la interacción con los NMDAr, existe sólo una evidencia que la vincula con la subunidad NR2A. Esta relación se evaluó in vitro y en células intactas, e indica que Cdk5 fosforila directamente NR2A en la serina 1232. Esta fosforilación se revierte por acción de Roscovitina (inhibidor selectivo de Cdk5) y bloquea la inducción de LTP y las correintes eléctricas evocadas por NMDA en neuronas hipocampales de CA1 de rata (Li et al., 2001). Por otra parte, la literatura demuestra que existen múltiples formas de interacción entre Cdk5 y la subunidad
170
NR2B en mecanismos relacionados a la plasticidad sináptica y al aprendizaje (Morabito et al., 2004; Hawasli et al., 2007; Zhang et al., 2008a). Si bien la acción de Cdk5 sobre esta subunidad es indirecta, ya que la subunidad NR2B no posee sitio de fosforilación para Cdk5, su interacción se realiza a través de la proteína PSD-95 (Bianchetta et al., 2012), como se describió anteriormente, e interrumpiendo la interacción entre PSD-95 y NR2B, que, al no estar unida a PSD-95, se internaliza (Lavezzari et al., 2003). Nuestro resultado preliminar apoya a esta corriente de evidencias, concluyendo que en procesos de adquisición de aprendizaje NR2B es requerido (Figs.22ay 23a) y, por ende, la relación entre PSD-95 y Cdk5 no se encuentra favorecida (Fig.24).