Considered Methodologies

10.1. Digestión del vector y anillamiento de oligonucleótidos

Se llevó a cabo la digestión de 2 µg del plásmido pGreenPuro siguiendo el protocolo de la casa comercial del vector, con 0.5 µl de las enzimas de restricción EcoRI y BamHI (20U/µl, NEB), 33.8 µl de H2O, 5 µl 10x NEB 3 buffer y 0.2 µl 100x BSA (Bovine Serum Albumin), durante dos horas a 37ºC. A partir de la electroforesis en gel de agarosa se cortó la banda obtenida, se purificó utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) y se cuantificó mediante el espectrofotómetro de microvolúmenes (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific).

Los oligonucleótidos se disolvieron en H2O hasta una concentración final de 20µM, y se realizó la reacción de anillamiento o annealing, reacción mediante la cual las secuencias complementarias del DNA o RNA de cadena simple se unen mediante enlaces puentes de hidrógeno, formando una cadena doble. Para ello se llevó a cabo la reacción de anillamiento en un volumen final de 20 µl: se empleó 1 µl de cada uno de los oligonucleótidos sentido y antisentido (concentración final de 1 µM cada oligonucleótido) y 18 µl del tampón de anillamiento (10 mM Tris, 50 mM de NaCl, 1mM EDTA). Se desnaturalizó la mezcla de reacción durante 2 minutos a 95ºC y se dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez que finalizó la reacción, la muestra se diluyó 1:20 en tampón 1X TE (10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA) o H2O libre de nucleasas para continuar con la reacción de ligación.

10.2. Reacción de ligación

Para realizar una ligación, se usó el DNA del vector digerido e inserto/s. La relación molar del DNA vector con respecto al DNA del inserto fue de 1:3. Se utilizó el kit de ligación Rapid DNA Dephos and Ligation Kit de Roche.

Para llevar a cabo la reacción de ligación, en el primer paso se mezclaron el DNA del vector y el DNA del inserto en el tampón de dilución (5X DNA dilution buffer). Esto

durante 15 min a temperatura ambiente. La reacción de ligación se utilizó inmediatamente para transformar en bacterias termocompetentes, o bien, se almacenó a -20ºC hasta su uso.

10.3. Preparación de bacterias Escherichia coli DH5a químicamente competentes

A partir de la cepa comercial, se obtuvieron en el laboratorio bacterias Escherichia coli DH5a químicamente competentes. En primer lugar, se sembraron las bacterias comerciales en una placa de LB-agar sin antibiótico, incubándose durante 16 horas a 37ºC. Después se picó una colonia aislada y se cultivó en 2 ml de medio líquido LB durante 16 horas a 37ºC en agitación. Una vez transcurrido este tiempo se inoculó 1 ml de este cultivo en 50 ml de LB líquido y se incubó de nuevo a 37ºC en agitación hasta obtener una densidad óptica (DO) a 600 nm de 0.4 a 0.6. A continuación, se centrifugó el cultivo bacteriano a 4.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet de bacterias en 15 ml de tampón CMG (50 mM CaCl2 y 50 mM MgCl2), y se incubó durante 15 minutos en hielo. Tras la incubación, la suspensión bacteriana se centrifugó en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Se descartó el sobrenadante y el pellet bacteriano se resuspendió en 3.6 ml de tampón CMG y se incubó de nuevo en hielo durante 5 minutos. Finalmente se añadieron 250 µl de DMSO y se incubó por última vez en hielo durante 5 minutos. Las bacterias competentes obtenidas se almacenaron en alícuotas a -80ºC.

10.4. Transformación bacteriana

Para realizar la transformación bacteriana, se descongelaron las bacterias Escherichia coli DH5a químicamente competentes en hielo. Se añadieron 50 ng de plásmido o 2 µl del producto de ligación (10-30 ng) a 50 µl de bacterias competentes. Se dejó la mezcla en hielo 20 minutos. Pasado este tiempo de incubación, la mezcla se sometió a un choque térmico de 55 segundos a 43ºC. Luego se incubó la muestra otros 2 minutos en hielo, se añadió 1 ml de LB líquido y se incubó 1 hora a 37ºC en agitación. Posteriormente, se centrifugó la muestra 2 minutos a 12.000 rpm y se retiraron 850 µl del sobrenadante. Se resuspendió el pellet bacteriano, que se sembró en placa de LB agar en presencia del antibiótico de selección: ampicilina (50 µg/ml) cloranfenicol (10 µg/ml) o kanamicina (30 µg/ml). Las placas de cultivo se incubaron a 37ºC durante 12-16 horas.

10.5. Purificación de plásmidos a pequeña escala (miniprep)

Se tomaron colonias aisladas de una placa de LB agar en presencia del antibiótico de selección, se cultivaron en 2 ml de medio LB líquido en presencia del mismo antibiótico durante toda la noche a 37ºC en agitación. El pellet bacteriano obtenido mediante la centrifugación del cultivo se resuspendió en 100 µl de buffer de resuspensión (50 mM Tris y 10 mM EDTA, pH 8.0). Luego, se añadieron 100 µl de buffer

de lisis (0,1 M NaOH y 1 % SDS), se mezclaron los viales por inversión para mezclar las soluciones y se incubaron 4 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se añadieron 100 µl de buffer neutralizador (1.5 M de acetato potásico, pH 5.5), se mezcló nuevamente por inversión y se centrifugó 5 minutos a 15.000 rpm. Se recogió el sobrenadante y se añadieron 900 µl de etanol absoluto (100 %) frío para precipitar el DNA plasmídico. Se invirtieron los viales para mezclar las soluciones y se incubaron durante 10 minutos a -20ºC. Finalmente, se centrifugaron los viales a 15.000 rpm durante 10 minutos, tras lo cual se retiró el sobrenadante y se añadió sobre el pellet 700 µl de etanol al 70 %. Se centrifugaron de nuevo los viales a 15.000 rpm durante 5 minutos, se retiró el sobrenadante y se dejó secar el pellet durante 5 minutos a temperatura ambiente. Por último, se resuspendió el DNA plasmídico en 50 µl de TE 1X y se empleó el espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fischer) para su cuantificación.

10.6. Purificación de plásmidos a mediana escala (midiprep)

La extracción de plásmido a mediana escala se realizó utilizando el kit comercial PureLink™ HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit (Invitrogen). El principio de este kit se basa en la lisis alcalina de las bacterias, seguido por la adsorción del DNA a una membrana de sílica presente en una columna. Esta columna separa el DNA del resto de la muestra.

Las bacterias procedentes de 100 ml de cultivo se resuspendieron en 4 ml de tampón R3 (tampón de resuspensión). A continuación, se añadieron 4 ml de tampón L7 (tampón de lisis), se mezclaron las soluciones mediante inversión y se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente. Después se añadieron 4 ml de tampón N3 (tampón neutralizador), se invirtieron los viales de nuevo para mezclar las soluciones. Posteriormente se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se añadió el sobrenadante a una columna de sílica previamente equilibrada con 10 ml de tampón EQ1 (tampón equilibrador). Cuando el líquido atravesó la membrana, la columna se lavó

centrifugar para eliminar los restos del alcohol. Finalmente, se resuspendió el DNA en TE, se cuantificó y almacenó a -20ºC.