Data Analysis

Como ya se ha explicado antes el 50 % de la proteína FASTK se localiza en la mitocondria (mitoFASTK) mientras que el resto se distribuye entre el núcleo y el citosol (cytoFASTK). La isoforma mitocondrial de FASTK se sintetiza a través de un sitio alternativo de iniciación de la traducción (metionina 35) y carece de los primeros 34 aminoácidos presentes en el extremo N-terminal de la proteína FASTK, mostrando una señal de localización mitocondrial (Jourdain et al., 2015).

Para conocer si la isoforma mitocondrial de FASTK es la responsable del fenotipo fagocítico que hemos observado en los resultados descritos anteriormente, se llevaron a cabo experimentos de rescate. Para ello, se generaron con lentivirus células

RAW 264.7 que expresaban shRNA contra la región 5’UTR de FASTK. En primer lugar, se diseñaron tres oligonucleótidos diferentes (shUTR57, shUTR18-1, shUTR18-2) contra esta región de FASTK. Se llevó a cabo la clonación de los insertos shRNA en el vector pGreenPuro, y se realizó la transfección en las células empaquetadoras 293FT como se detalla en la sección de Material y Métodos, y posteriormente se realizó la transducción en las células RAW 264.7. Las células silenciadas en la región 5’UTR de FASTK fueron seleccionadas en presencia de puromicina (7 µg/ml) y monitorizadas mediante microscopia de fluorescencia y qRT-PCR. Estos shRNA mostraron una disminución en la expresión del gen, como se muestra en la figura 32. En los experimentos del estudio planteado se empleó el knockdown shUTR 18-2, a partir de ahora denominado shUTR.

Figura 32. Gráfico en el que se muestra la expresión relativa de los diferentes shRNA (shUTR57, shUTR 18-1 y shUTR 18-2) contra la región 5’UTR de FASTK obtenidos en

la línea celular RAW 264.7 mediante qRT-PCR, aplicando la fórmula 2-DDCt_{. El control empleado}

fue el vector vacio (shpGreenPuro). El gen b-actina ha sido utilizada como normalizador. Análisis estadístico t de Student, unpaired t test, two-tailed. Los resultados se representan como la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. *** indica p<0.001.

Se empleó un shRNA contra la región 5’UTR porque la expresión puede ser rescatada con vectores que expresan la región codificante de FASTK(y no poseen la 5’ UTR). Las células que expresaban shUTR se transfectaron con los siguientes constructos: el constructo que codificaba solo la proteína roja fluorescente RFP (RFP), el constructo que contenía dos sitios de iniciación de la traducción y codifica la isoforma mitocondrial y citoplasmática de FASTK (FASTK WT RFP), y el constructo FASTK delecionado que comienza en la metionina interna en la posición 35, mitoFASTK, (FASTK D1-34). Todos ellos expresan RFP en la terminación carboxilo y fueron cedidos gentilmente por la Dra. Nancy Kedersha y el Dr. Paul Anderson (Universidad de Harvard,

Figura 33. Imagen en la que se muestra el resultado obtenido mediante digestión con las enzimas de restricción KpnI/HindIII de los constructos FASTK WT RFP (1649 bp) y FASTK D1-34 (1547 bp), en el orden descrito.

Las células RAW 264.7 silenciadas en la región 5’UTR (shUTR) fueron transfectadas con RFP (como control), FASTK WT RFP, y FASTK D1-34.

Se realizaron curvas de respuesta a diferentes dosis de G418 (0.1 a 2 mg/ml), con el fin de determinar la concentración más baja de antibiótico capaz de matar al 100 % de las células no transfectadas en el transcurso de una semana, que resultó ser de 1 mg/ml. Las células transfectadas se seleccionaron con 1 mg/ml G418 durante 15 días, y en presencia de puromicina (7 µg/ml) ya que el vector donde se silenció FASTK para la región 5’UTR tenía un gen de resistencia a la puromicina, como ya se ha indicado. La expresión de los constructos RFP se evaluó utilizando el microscopio de fluorescencia (Texas-Red).

Una vez que obtuvimos las células para los experimentos de rescate, se realizaron los ensayos de fagocitosis. Las bacterias fueron marcadas con TRITC y el índice fagocítico se evaluó como se ha descrito en la figura 29. Como se muestra en la figura 34, la re-expresión de FASTK D1-34, fue capaz de rescatar el fenotipo fagocítico de las células delecionadas en FASTK. El IF de los macrófagos shUTR frente a E.coli

está aumentado respecto a las células control (232.4 ± 10.13 % versus 100 ± 0.77 %,

p<0.0001) y el IF frente a E.coli está disminuido en las células shUTR + WT-RFP en

comparación con los macrófagos shUTR (112.3 ± 10.86 % versus 232.4 ± 10.13 %,

p<0.0001). Como se puede observar (Figura 34), hay una mayor disminución en el

shUTR (71.70 ± 4.38 % versus 232.4 ±10.13 %, p<0.0001). Asímismo, se confirma el mismo fenotipo descrito con la bacteria S.aureus, dado que el IF para S.aureus está aumentado en las células shUTR respecto a las células control (174.8 ± 8.63 % versus 100 ± 1.30 %, p<0.0001), sin embargo el IF para S.aureus está disminuido en los

macrófagos shUTR + WT-RFP en comparación con los macrófagos shUTR (92.49 ± 3.71 % versus 174.8 ± 8.63 %, p<0.0001). Precisamente, se observa una mayor

disminución en el índice fagocítico para S.aureus en las células shUTR + D1-34-RFP respecto a las células shUTR (63.93 ± 4.57 % versus 174.8 ± 8.63 %, p<0.0001).

Figura 34. Índice fagocítico de E.coli y S.aureus en las células RAW 264.7 en las que se ha silenciado FASTK y los constructos de rescate. Las células que expresan shUTR se transfectaron con RFP, FASTK WT RFP y FASTK D1-34 RFP. El control es el vector vacio (shpGreenPuro). En la imagen inferior se representa de forma esquemática los contructos empleados en el estudio: FASTK WT-RFP y FASTK D1-34. MTS, señal de localización mitocondrial; tres dominios conservados de los miembros de la familia FASTK: FAST_1, FAST_2 y RAP. Media ± error estándar (n>6 experimentos independientes), ***p<0.001 (t de Student).

De nuevo, se llevaron a cabo los experimentos de fagocitosis con el ensayo de protección a la gentamicina a la hora de la infección con E.coli y S.aureus. El número de colonias de E.coli y S.aureus en los macrófagos shUTR + D1-34-RFP muestran una disminución en el número de colonias en comparación con los macrófagos shUTR. En E.coli se obtuvieron 192.5 ± 15.88 UFC/pocillo versus 585.8 ± 250.3 UFC/pocillo, p<0.05. Mientras que en S.aureus se obtuvieron 7317 ± 526.9 UFC/pocillo versus 18183 ± 1674 UFC/pocillo, p=0.0035 (Figura 35).

Figura 35. Capacidad fagocítica en E.coli y S.aureus en las células RAW 264.7 en las que se ha silenciado FASTK y los constructos de rescate. Se representa la media ± error estándar (n=3). *p<0.05, Análisis estadístico t de Student, unpaired t test, two- tailed.

Estos resultados demostraron que mitoFASTK es un regulador de la fagocitosis de bacterias en los macrófagos a través de la regulación de la actividad del complejo I de la mitocondria.

4. Estudio de la activación de AMPK en la fagocitosis no opsónica de bacterias