3.3 Text Analysis Component
3.3.2 Content Analysis for Domain Text
fue detectada por RP-TLC en la cepa R. sp. LPU83 (pMP604). De la misma manera, el mutante nodH denominado R. sp. LPU83-H previamente descripto por Del Papa et al.
(2007) fue también evaluado al introducirle el plásmido pMP604. El resultado obtenido mostró que la cepa R. sp. LPU83-H (pMP604) presentaba un patrón de bandas diferentes que la cepa R. sp. LPU83 (pMP604) cuando se realizó la RP-TLC (Figura V.4). Estas últimas cepas nos dieron la posibilidad de preparar NFs en cantidades suficientes para realizar la determinación de sus estructuras químicas.
Figura V.4. Análisis de los NFs producidos por R. sp.
LPU83 y R. sp. LPU83‐H mediante el uso de RP‐TLC.
Línea A, R. sp. LPU83, y línea B, R. sp. LPU83‐H. Ambas
cepas poseen el plásmido pMP604 que contiene un
activador transcripcional independiente de flavonoides
(nodDFITA). Las flechas indican especies de NFs en cada
cepa.
V.6.
Análisis estructural de los factores de nodulación producidos por la
cepa R. sp. LPU83.
Luego de encontrar las condiciones para inducir la producción de NFs en la cepa R. sp. LPU83, los mismos fueron purificados para las cepas R. sp. LPU83 (pMP604) y R. sp. LPU83-H (pMP604) desde cultivos inducidos con luteolina (la producción de NFs se ve levemente estimulada por el agregado de luteolina). Una vez obtenido el extracto conteniendo los NFs (Ver Materiales y Métodos, sección II.5.c), los análisis mediante HPLC y MS/MS fueron realizados según Crespo-Rivas et al. (2009). De esta manera, pudimos identificar 9 tipos diferentes de NFs en la cepa salvaje R. sp. LPU83 y 24 tipos en
el mutante R. sp. LPU83-H. En la Tabla V.1 se realiza un resumen de las estructuras químicas de los diferentes NFs identificados, y en la Figura V.5 se observan los espectros MS/MS de NFs representativos de cada cepa. Los NFs identificados fueron trímeros, tetrámeros y pentámeros de N-acetil-glucosamina y mostraron diferentes sustituyentes químicos en sus residuos terminales, tanto en el extremo reductor como en el no reductor.
Las cadenas unidas al extremo no reductor del oligómero de glucosamina mostraron diferentes longitudes y número de insaturaciones (Tabla V.1). La mayoría de los NFs aislados de la cepa R. sp. LPU83 se encontraron sulfatados en el residuo del extremo reductor.
Llamativamente, ninguno de los NFs aislados del mutante nodH de la cepa R. sp. LPU83 se encontraba sulfatado. La carencia de sulfato en los NFs de la cepa R. sp. LPU83-H claramente sugiere que no hay homólogos funcionales de nodH (sulfotransferasas) en estos rizobios. Previamente se demostró que el mutante nodH de la cepa R. sp. LPU83 era capaz de nodular alfalfa (Del Papa, et al., 2007), así, podemos afirmar que este mutante es capaz de nodular alfalfa con NFs que no se hallan sulfatados, lo cual es de vital importancia para la interacción entre el simbionte eficiente, E. meliloti, y alfalfa (Faucher, et al., 1988; Cloutier, et al., 1996; Wais, et al., 2002).
Es interesante observar que la mayoría de los NFs se encontraron N-metilados en el residuo del extremo no reductor, una característica típica de los rizobios noduladores de poroto (Poupot, et al., 1993; Poupot, et al., 1995). Esta modificación de los NFs es llevada a cabo por una proteína codificada por el gen nodS (Geelen, et al., 1995). Krishnan et al.
(1992), demostraron que el gen nodS es capaz de extender el rango de hospedadores de ciertos rizobios. La presencia de NFs metilados en los rizobios tipo Oregon podría explicar la capacidad de los mismos para nodular poroto y Leucaena leucocephala (Folch-Mallol, et al., 1996). En estos rizobios no ha sido reportada la presencia de ortólogos de nodS y no los hemos encontrado in silico. Tampoco se han encontrado NFs metilados en E. meliloti
(Perret, et al., 2000). La N-metilación de los NFs en los rizobios tipo Oregon refleja, a nivel químico, la relación conocida entre estas bacterias y los rizobios noduladores de poroto. En la Tabla V.2 se puede observar la comparación entre los NFs de diversos rizobios, incluyendo los noduladores de poroto o alfalfa. Claramente se puede observar que los NFs de los rizobios tipo Oregon comparten características de ambos grupos. La longitud y el número de insaturaciones de las cadenas de ácidos grasos, como la presencia de un grupo metilo en la posición R1, son similares a las presentes en Rhizobium tropici o Rhizobium etli; mientras que los sustituyentes en las posiciones R2 a R6 son similares a los presentes en E. meliloti.
Figura V.5. Análisis por HPLC y espectrometría MS/MS de los LCOs purificados. La figura muestra los
perfiles de ruptura para un NF característico de las preparaciones. En el panel A se muestra el espectro
de un NF sulfatado de R. sp. LPU83 (pMP604), el ion evaluado posee una relación m/z = 1348,4
(marcado con un recuadro rojo), obtenido a un tiempo de retención de 14,2 min (Correspondiente a
V(C18:2,NMe,S)). Mientras que el primer pico, marcado en celeste presenta m/z = 1268,48. La diferencia
entre estas relaciones coincide con la pérdida del sulfato antes de la ruptura, lo que suele suceder por lo
lábil del enlace. En el panel B se muestra el espectro de masa de un NF de la cepa R. sp. LPU83‐H
(pMP604), el ion evaluado posee una relación m/z = 1268,48 (marcado con un recuadro rojo), obtenido
a un tiempo de retención de 14,0 min (Correspondiente a V(C18:2,NMe)). El primer pico, marcado en
celeste presenta m/z = 1268,48, demostrando que no ha cambiado su estructura al momento de la