Core Experiments on VAE-EDA-Q and VAE-EDA-Q AVS

El procedimiento del método de Marfey consiste en los siguientes pasos (Figura 8):

1- Hidrólisis del péptido: Se realiza una hidrólisis ácida del péptido para obtener sus aminoácidos de forma libre.

2- Derivatización química de estos aminoácidos libres con el reactivo de Marfey (L-FDAA).

3- Derivatización química de los patrones de los aminoácidos objeto de estudio en su forma L y D.

4- Diseñar un método de separación de los diastereoisómeros obtenidos.

5- Identificación de los aminoácidos mediante LC/MS por monitorización selectiva del ion de relación m/z y posterior comparación de los tiempos de retención con los patrones derivatizados con L-FDAA.

Péptido aa libre L,,D L-aa estándar D-aa estándar Hidrólisis UV Tr UV Tr UV Tr L-L-FDAA D-L-FDAA L-L-FDAA L-FDAA L-FDAA L-FDAA D-L-FDAA

Una vez obtenido nuestro aminoácido problema libre por hidrólisis ácida del péptido y posterior derivatización, se compara con las configuraciones L y D del patrón de dicho aminácido. Para ello, previamente se desarrolla un método de separación para ambas configuraciones del aminoácido identificándolos mediante la monitorización selectiva del ion de relación

m/z el HPLC-MS y determinando el tiempo de retención determinado para cada configuración. A continuación, se realiza el mismo método de separación al aminoácido problema y se compara el tiempo de retención obtenido con los de los patrones.

1.6.2 Método avanzado de Marfey

Este método se utiliza para determinar la estereoquímica de los aminoácidos sin necesidad de tener los patrones de los aminoácidos. Es muy útil cuando no disponemos en el laboratorio de los patrones o bien hay que sintetizarlos.

Esta metodología se basa en que el diastereoisómero L-L eluye antes que el diastereoisómero D-L en un método de separación por HPLC.23 La explicación se debe a que en el caso del diastereoisómero L-L, el grupo carboxilo del aminoácido se encuentra más próximo al grupo carboxamida que en el caso del diastereoisómero D-L, facilitando la formación del enlace de hidrógeno. La formación de este enlace entre ambos grupos no se produce en el diastereoisómeros D-L, lo que provoca que su molécula presente una forma menos simétrica que se traduce en una mayor interacción con las cadenas hidrocarbonadas del relleno de las columnas

23

de HPLC de fase inversa, con el consiguiente aumento en el tiempo de retención. En la Figura 9 se muestra la distancia entre el hidrógeno del grupo carboxilo y el oxígeno de la carboxamida para los diastereoisómeros de la valina. Se observa que para el caso del diastereoisómero L-L, esta distancia es menor (8.28 A) con respecto a la del diastereoisómero D-L (9.92 A).

8.28 A

9.92 A

L-Val-L-FDAA D-Val-L-FDAA

Figura 9. Estructuras de los diastereoisómeros de la valina (L-L y D-L) y distancia entre el hidrógeno y oxígeno de grupos carboxilo y carboxamida.

En 1997 Harada y col,24 publicaron los tiempos de retención de lo diastereoisómeros L y D de los aminoácidos más comunes. (Tabla 1)

Tabla 1. Aminoácidos, tiempos de retención (min) de sus diastereoisómeros L y D, orden de elución y diferencia entre los tiempos de retención (min).

Se observa que prácticamente el diastereoisómero L de la mayoría de los aminoácidos eluye antes que el diastereoisómero D. El orden de elución varía solamente en los aminoácidos ornitina, histidina (mono ) y citrulina, mientras que para N-metil alanina fue imposible separarlos. El procedimiento del método avanzado de Marfey consiste en (Figura 10):

1- Hidrólisis del péptido: Se realiza una hidrólisis ácida del péptido para obtener sus aminoácidos de forma libre. Se dividen en dos fracciones

2- Derivatización química de la primera fracción de estos aminoácidos libres con el reactivo de Marfey (L-FDAA).

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Fujii, K.; Ikai, Y.; Mayumi, T.; Oka, H.; Suzuki, M.; Harada, K. Anal. Chem.1997, 69, 3346–3352.

Aminoácido Orden de elución Tiempo de retención (L) (min) Tiempo de retención (D) (min) Diferencia (min) Aminoácido Orden de elución Tiempo de retención (L) (min) Tiempo de retención (D) (min) Diferencia (min) Alanina L-D 14.8 19.1 4.3 Asparagina L-D 6.7 7.3 0.6

Ácido 2-amino-n-butirico L-D 17.9 23.8 5.9 Ácido glutámico L-D 10.8 13.1 2.3

Norvalina L-D 24.0 30.4 6.4 Ácido aspártico L-D 8.2 9.8 1.6

Norleucina L-D 29.9 36.5 6.6 Lisina (mono-) L-D 10.6 10.8 0.2

Valina L-D 23.2 29.7 6.5 Lisina (di) L-D 31.4 34.5 3.1

Leucina L-D 29.6 35.9 6.3 Ornitina (mono-) D-L 9.4 8.5 -0.9

Isoleucina L-D 28.7 35.3 6.6 Ornitina (di) D-L 28.5 26.0 -2.5

Metionina L-D 20.2 26.4 6.2 Histidina (mono-) D-L 6.7 6.0 -0.7

Fenilalanina L-D 27.7 33.2 5.5 Histidina (di) L-D 21.9 25.3 3.4

Tirosina L-D 37.8 42.6 4.8 Arginina L-D 9.3 9.6 0.3 Prolina L-D 15.7 18.2 2.5 Citrulina D-L 10.7 10.0 -0.7 Serina L-D 9.2 9.9 0.7 N-metilalanina _ 18.4 18.4 0.0 Homoserina L-D 9.0 10.5 1.5 N-metilfenilalanina L-D 30.3 30.9 0.6 O-metilserina L-D 12.3 17.2 4.9 N-metilvalina L-D 28.8 32.4 3.6 Treonina L-D 10.4 14.8 4.4 N-metilisoleucina L-D 32.8 35.4 2.6

allo-treonina L-D 10.4 12.3 1.9 Ácido N-metilaspártico D-L 11.4 9.8 -1.6

3- Derivatización química de la segunda fracción de los aminoácidos libres con una mezcla racémica del reactivo de Marfey: L-FDAA + D- FDAA.

4- Diseñar un método de separación de los diastereoisómeros obtenidos.

5- Identificación de los aminoácidos mediante LC/MS por monitorización selectiva del ion de relación m/z. De los dos diastereoisómeros obtenidos de cada aminoácido, el primero que eluye corresponde al aminoácido con configuración L.

Figura 10. Metodología aplicada para realizar el método avanzado de Marfey.

Como conclusión, cuando disponemos de los patrones de los aminoácidos que queremos analizar, el método de Marfey es el más utilizado para la determinar la estereoquímica de los aminoácidos debido a que es una metodología sencilla y rápida. En aquellas ocasiones que no disponemos de dichos patrones, el método avanzado de Marfey es la alternativa para resolver el problema. UV Tr UV Tr L-FDAA L-FDAA D-FDAA L-L-FDAA L-D-FDAA D-D-FDAA D-L-FDAA D-L-FDAA L-L-FDAA L-D-FDAA D-D-FDAA L-L-FDAA D-L-FDAA Péptido aa libre_L,,D Hidrólisis

1.7 Determinación de estereoquímica absoluta de alcoholes: Método de