of 8 Database , Vol 2019, Article ID baz081 hyperarousal (1) PTSD pathophysiology is complex and

Para determinar la localización subcelular del complejo MT1-MMP/LRP1 se llevaron a cabo ensayos de endocitosis continua de α2M* durante 60 min en células MIO-M1

transfectadas o no con una construcción que codifica para la proteína MT1-MMP-GFP. Luego se procedió a realizar FD, IFI de LRP1 y MC. La figura 4.37 muestra que α2M*

indujo un incremento significativo de la colocalización de MT1-MMP-GFP con LRP1 (62 ± 2%) en vesículas perinucleares, en comparación con células no estimuladas (21 ± 1%). Por otra parte, la colocalización de MT1-MMP-GFP y LRP1 no se evidenció en las regiones cercanas a las protuberancias celulares (recuadros 1 y 3) de células estimuladas con α2M*, lo que indica que ocurrió mayoritariamente a nivel perinuclear (recuadros 2 y 4).

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Figura 4.37. Colocalización de MT1-MMP-GFP con LRP1 en células MIO-M1. Ensayo de endocitosis continua de 2M*, seguido de FD e IFI y analizado por MC. A) Distribución subcelular de la colocalización

de MT1-MMP-GFP y LRP1, en ausencia y presencia de α2M* (paneles control y α2M*, respectivamente).

También se observan ampliaciones (recuadros 1–4, zoom digital 4X) de las protuberancias celulares (1 y 3) y de las regiones perinucleares (2 y 4) de las células, provenientes de las imágenes combinadas. Las puntas de flecha indican vesículas que contenían ambas proteínas (colocalización). Las imágenes son representativas de 15 imágenes por condición, provenientes de tres experimentos independientes. La barra de escala corresponde a 15 µm. B) Medias ± DE de los coeficientes de colocalización (proporción de vesículas que contenían MT1- MMP-GFP y eran LRP1 positivas) en ausencia y presencia de α2M*, obtenidos a partir de las cuantificaciones

realizadas en al menos 20 células por condición. La comparación estadística de las medias se llevó a cabo a través de la prueba τ-Student para muestras independientes. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p < 0,05).

Con el propósito de determinar si el aumento de los niveles de colocalización entre ambas proteínas es dependiente de la interacción α2M*/LRP1, se llevó a cabo un ensayo de

endocitosis continua de α2M* Alexa488 en células MIO-M1 en ausencia y presencia de

GST-RAP, seguido de FD, IFI de MT1-MMP y LRP1. La figura 4.38 muestra que la colocalización de MT1-MMP y LRP1 en ausencia de GST-RAP es significativamente mayor (51 ± 7%) al nivel de colocalización en presencia de esta proteína (19 ± 3%). Resultó interesante observar un importante número de vesículas que contenían α2M*

Alexa488, MT1-MMP y LRP1 (imagen binaria, colocalización triple), lo que sugirió que la asociación molecular se produciría en EE del tipo endosomas de sorting.

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Figura 4.38. Inhibición de la colocalización de MT1-MMP con LRP1 en células MIO-M1. Ensayo de endocitosis continua de 2M* Alexa488 en células MIO-M1, seguido de FD e IFI y analizado por MC. A)

Distribución subcelular de 2M* Alexa488 (primera columna), de MT1-MMP (segunda columna), de LRP1

(tercera columna) y de la colocalización de las tres proteínas (Merge), en ausencia y presencia de GST-RAP (primera y segunda fila, respectivamente). También se observan ampliaciones (quinta columna, zoom digital 4X) de las regiones perinucleares de las células provenientes de las imágenes Merge (recuadros), y sus correspondientes imágenes binarias (columnas sexta y séptima), en las que se muestran en color blanco los pixeles que colocalizaron (sexta columna, colocalización triple; séptima columna, colocalización MT1- MMP/LRP1). Las imágenes son representativas de 15 imágenes por condición, provenientes de tres experimentos independientes. La barra de escala corresponde a 10 µm. B) Medias ± DE de los coeficientes de colocalización (proporción de vesículas que contienen MT1-MMP y son LRP1 positivas) en ausencia y presencia de GST-RAP, obtenidos a partir de las cuantificaciones realizadas en al menos 20 células por condición. La comparación estadística de las medias se llevó a cabo a través de la prueba τ-Student para muestras independientes. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p < 0,05).

Con el propósito de corroborar que la asociación de MT1-MMP y LRP1 tuvo lugar en EE del tipo endosomas de sorting, se procedió a realizar un ensayo de endocitosis continua de α2M* en células MIO-M1 transfectadas con el plásmido que codifica para la proteína MT1-

MMP-GFP. Luego se procedió a realizar FD, IFI de LRP1 y EEA1. La figura 4.39 muestra que el nivel de colocalización de MT1-MMP-GFP y EEA1 (vesículas que contenían MT1- MMP-GFP y eran EEA1 positivas) en células estimuladas con α2M* fue significativamente

mayor (50 ± 5%) respecto al observado en las células no estimuladas (15 ± 1%). Del mismo modo, LRP1 también evidenció un aumento significativo de su colocalización con

106 vesículas EEA1 positivas (57 ± 1%) en células MIO-M1 estimuladas con α2M*, en

comparación con células no estimuladas (30 ± 2%), tal como se observó anteriormente (sección 4.1.3.2). En las imágenes Merge (MT1-MMP-GFP/LRP1/EEA1), así como en sus ampliaciones e imágenes binarias, es posible apreciar que el nivel de colocalización de las tres proteínas fue mayor en células MIO-M1 estimuladas con α2M* respecto a células no

estimuladas. En conjunto, estos resultados demostraron que α2M* promovió la acumulación

de la proteína MT1-MMP en EE del tipo endosomas de sorting LRP1 positivos.

Figura 4.39. Colocalización de MT1-MMP-GFP con LRP1 en endosomas de sorting de células MIO- M1. Ensayo de endocitosis continua de 2M* seguido de FD e IFI y analizado por MC. A) Distribución

subcelular de MT1-MMP-GFP (primera columna), de LRP1 (segunda columna), de EEA1 (tercera columna) y de la colocalización de las tres proteínas (Merge), en ausencia y presencia de 2M* (primera y segunda fila,

respectivamente). También se observan ampliaciones (quinta columna, zoom digital 4X) de las regiones perinucleares de las células provenientes de las imágenes Merge (recuadros) y su correspondiente imagen binaria (sexta columna) en la que se muestra en color blanco los pixeles que colocalizaron. Las imágenes son representativas de 15 imágenes por condición, provenientes de tres experimentos independientes. La barra de escala corresponde a 20 µm. B) Medias ± DE de los coeficientes de colocalización (proporción de vesículas que contienen MT1-MMP-GFP y son EEA1 positivas, a la izquierda; proporción de vesículas que contienen LRP1 y son EEA1 positivas, a la derecha) en ausencia y presencia de 2M*. Los coeficientes de

colocalización se obtuvieron a partir de las cuantificaciones realizadas en al menos 20 células por condición. La comparación estadística de las medias se llevó a cabo a través de la prueba τ-Student para muestras independientes. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p < 0,05).

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