Transfecciones transientes de células MIO-M1
El día previo a la transfección se repicaron las células en medio sin antibióticos a una confluencia del 80-90%. Al día siguiente se realizaron las mezclas de reacción, considerando para cada µg de plásmido, 2 µL de Lipo2000 (relación 1:2). Para la realización de las mezclas correspondientes se siguieron las especificaciones del fabricante.
Mientras transcurrieron los tiempos de incubación de los complejos, las células se lavaron exhaustivamente con HBSS 1X. Luego se adicionó a cada well la cantidad necesaria de medio para transfección de células eucariotas que permitió cubrir el volumen mínimo de trabajo, según el fabricante de las placas. Finalmente se procedió a adicionar la mezcla DNA/Lipo2000 correspondiente para cada well.
La transfección se llevó a cabo durante 4 h y luego de dicho período de tiempo se retiró el medio de reacción y se reemplazó con medio de cultivo celular. Los ensayos se llevaron a cabo 48-72 h luego de la transfección.
Ensayo de unión-endocitosis
Células MIO-M1 sobre coverslips de vidrio o placas de petri de plástico fueron lavadas con PBS 1X a 4 °C (3 x 5 min) y colocadas sobre hielo para detener el transporte intracelular (esta condición de temperatura se mantuvo hasta la etapa de endocitosis). Luego fueron incubadas con diluciones a 4 °C de α2M*, α2M* Alexa488 o α2M* Alexa594 (60 nM) durante
30 min. Paso siguiente se llevaron a cabo lavados con PBS 1X a 4 °C (5 x 5 min) para remover el ligando no unido. Finalmente, las células se llevaron a 37 °C y se incubaron con medio de incubación durante los tiempos requeridos por el ensayo. Una vez cumplidos dichos tiempos, para frenar la endocitosis del ligando, se colocaron nuevamente sobre hielo y se lavaron con PBS 1X a 4 °C (2 x 5 min). En el caso de los ensayos con α2M* Alexa488 y
α2M* Alexa594, salvo las condiciones de control de unión de ligando, el resto se sometieron
a lavados ácidos fríos (1 x 5 min) con buffer glicina a 4 °C para eliminar los ligandos unidos pero no endocitados luego de la etapa de internalización. Paso siguiente se neutralizaron con medio volumen de solución neutralizadora y se lavaron con PBS 1X (2 x
46 3 min), ambos a 4 °C, para finalmente ser fijadas o lisadas para ensayos de microscopía o WB, respectivamente.
Ensayo de endocitosis continua o estimulación con α2M*
Células MIO-M1 cultivadas en medio de cultivo celular, fueron lavadas con HBSS e incubadas con medio de incubación durante 30 min previo al ensayo. Paso siguiente se lavaron nuevamente con HBSS y se sometieron a las correspondientes incubaciones con α2M*, α2M* Alexa488 o α2M* Alexa594 (60 nM) en medio de incubación. Luego se
procesaron para MC o WB.
Fluorescencia directa
Células MIO-M1 sobre coverslips de vidrio pre-adsorbidos con colágeno tipo I fueron fijadas con solución de paraformaldehído/Sacarosa 4% en PBS por 10 min y luego incubadas en solución de quenching por 20 min. Finalmente previos lavados con PBS (3 x 5 min en shaker) se montaron sobre portaobjetos de vidrio con solución de montaje. Se dejaron secar overnight a TA y al abrigo de la luz.
Inmunofluorescencia indirecta
Células MIO-M1 sobre coverslips de vidrio pre-adsorbidos con colágeno tipo I fueron fijadas con solución de paraformaldehído/Sacarosa 4% en PBS por 10 min, luego incubadas en solución de quenching por 20 min y permeabilizadas con solución de permeabilización y bloqueo por 25 min. Paso siguiente se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios diluidos en solución de dilución de anticuerpos a 37 °C por 60 min. Luego se lavaron con solución de permeabilización y bloqueo (5 x 3 min en shaker) y se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. Finalmente previos lavados con PBS (3 x 5 min en shaker) se montaron sobre portaobjetos de vidrio con solución de montaje. Se dejaron secar overnigth a TA y al abrigo de la luz.
Microscopía TIRF
Células MIO-M1 sobre coverslips de vidrio de (25 mm) previamente sometidas a ensayos de estimulación con ligandos fueron procesadas mediante IFI para LRP1 y se mantuvieron en PBS hasta su observación (no se realizó montaje). Los vidrios se dispusieron en un
47 accesorio especial que permitió utilizar como base el coverslip con las células y como medio PBS 1X.
Microscopía FRAP
Se siguieron los procedimientos detallados en (Zheng y col., 2011).
Citometría de flujo para proteínas de superficie
Células MIO-M1 sobre placas multiwell de 6 wells previamente sometidas a ensayos de estimulación con 2M* fueron procesadas para citometría de flujo. Brevemente, luego de
los ensayos de estimulación las placas se colocaron sobre hielo y se lavaron con PBS 1X frío (5 x 3 min), de manera de detener la reacción. Luego se les realizó un lavado con buffer
glicina (1 x 5 min) para despegar los ligando unidos al receptor. Paso siguiente se neutralizó con medio volumen de solución neutralizadora y se levantaron mediante
scrapper en 1 mL por well de detachingbuffer. Se centrifugaron a 4 °C 5 min a 2500 rpm. Los pellets se lavaron con FACS buffer (3 x 30 s con vortex) y se incubaron con diluciones de los anticuerpos correspondientes durante 30 min en hielo y al abrigo de la luz. Finalmente se adquirieron en el citómetro de flujo sin fijación previa.
Citometría de flujo para determinar porcentaje de transfección
Células MIO-M1 sobre placas multiwell de 6 wells previamente sometidas a ensayos de transfección transiente de plásmidos específicos se levantaron con solución de tripsina EDTA 10X por 60 s a 37 °C y se centrifugaron 5 min a 2500 rpm. Se levantaron en FACS
buffer y se adquirieron en el citómetro de flujo sin fijación previa.
Ensayo de migración bidimensional en la herida
Las actividades de migración celular se examinaron mediante un ensayo de wound-scratch
de 2 dimensiones en placas multiwell de 6 wells recubiertas con colágeno tipo I (10 µg/cm2; Sigma-Aldrich). Las células MIO-M1 (5x105 células/pocillo) se cultivaron durante 48 h a 37 °C en DMEM de alta glucosa conteniendo FCS al 10% y L-glutamina 2 mM con CO2 al
5%, seguido de incubación durante la noche hasta agotamiento de suero. En cada pocillo, se realizó una lesión lineal en el centro de la monocapa de células MIO-M1 con un tip estéril de 10 µL. Esta técnica produce una herida pronunciada carente de células, de aproximadamente 35 mm de largo y 400 µm de ancho. Luego, los wells se enjuagaron dos
48 veces con medio libre de suero para eliminar los residuos de células, y se añadieron 2 mL de DMEM de alta glucosa sin rojo de fenol. Las células fueron tratadas con 2M* 60 nM a
diferentes tiempos. Para bloquear la unión c-LRP1, las células fueron tratadas previamente con GST-RAP 400 nM durante 30 min. Luego de 24 horas post-transfección con siRNA- MT1-MMP, siRNA-LRP1 o shRNA-LRP1, las células MIO-M1 se cultivaron tal como se indicó previamente. Experimentos similares se llevaron a cabo con células MIO-M1 transfectadas con los plásmidos GFP-wt-Rab11 y GFP-Rab11S25N. La migración celular se midió siguiendo el procedimiento descrito previamente (Liang y col., 2007). Brevemente, en diferentes tiempos (0 y 12 h), se adquirieron 3 imágenes aleatorias por condición de la herida usando un dispositivo de carga acoplada (CCD) de la cámara (Nikon) en un microscopio de campo brillante (microscopio invertido Nikon TU-2000; Nikon, Tokyo, Japón) con un objetivo 10X (0,3 NA). Cada imagen representa un área promedio del equivalente de la herida de 5x105 ± 1x104 µm2 registrado en tiempo 0 h. Las células que invaden esta área se contaron en tiempo 12 h, y los resultados se expresaron como células por área.