The decision-making process and family

Para establecer las relaciones filogenéticas de las cuatro isoenzimas de cebada con las seis identificadas en arroz y las tres descritas en maíz (Carlson y col., 2002; Hirose y col., 2008), se utilizaron las secuencias aminoacídicas deducidas de las correspondientes proteínas SUSy. Estas 13 proteínas fueron

alineadas utilizando el programa ClustalW

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Se incluyeron, también, seis

nuevas isoformas de SUSy de Brachypodium distachyon, anotadas de la base de datos Brachypodium Genome Database (US Department of Energy Joint Genome Institute http://jgi.doe.gov/), denominadas BdSUS1-6, de acuerdo con su similitud con las de arroz. Además fueron incluidas en el análisis las seis enzimas sacarosa sintasa de A. thaliana (Barratt y col., 2001).

El alineamiento de las 25 secuencias se utilizó para reconstruir las relaciones filogenéticas mediante el método Neighbor-Joining, con el software MEGA 4.0 (Tamura y col., 2007). La topología del dendrograma que se muestra en la Figura 4.4, indicó que se podían establecer 3 grupos: (1) Grupo-1 específico de monocotiledóneas, donde se encontraron HvSS1 y sus ortólogas de maíz ZmSH1, arroz OsSUS1 y Brachypodium BdSUS1, así como HvSS2 y sus putativos ortólogos BdSUS3 y OsSUS3; (2) Grupo-1 específico de dicotiledóneas que incluyó sólo dos proteínas de Arabidopsis, AtSUS1 y AtSUS4; (3) Grupo-2 que contenía isoformas de sacarosa sintasa tanto de especies monocotíledoneas utilizadas como de la dicotiledónea Arabidopsis, donde se encontraban HvSS3, BdSUS4, ZmSUS3 y OsSUS4, así como AtSUS2 y AtSUS3; y (4) Grupo-3 que incluyó las isoformas SUS de cereales HvSS4, BdSUS5, OsSUS5, OsSUS6 y BdSUS6, y las de A. thaliana AtSUS5 y AtSUS6. Por tanto, las cuatro enzimas sacarosa sintasa de cebada se distribuyeron en tres grupos diferentes del dendrograma: HvSS1 y HvSS2 se encontraron en el Grupo-1 específico de monocotiledóneas, HvSS3 en el Grupo-2 y HvSS4 en el Grupo-3. Estas ramas se corresponden con los grupos Sus1, SusA y NG, respectivamente, descritos por Komatsu y col (2002).

Figura 4.4. Árbol filogenético con las secuencias deducidas de aminoácidos de las sacarosas sintasas de cereales. Se incluyen las secuencias de Arabidopsis en la comparación. Los números de acceso de los CDS: (1) Hordeum vulgare, HvSS1, X65871; HvSS2, X69931; HvSS3, AK242950; HvSS4, AK251329; (2) Zea mays, ZmSh1, X02400; ZmSUS1, L22296; ZmSUS3, AY124703; (3) Oryza sativa, OsSUS1, AK100334; OsSUS2, AK072074; OsSUS3, AK100306; OsSUS4, AK102158; OsSUS5, AK063304; OsSUS6, AK065549; (4) Brachypodium distachyon, BdSUS1, Bradi1g46670.1; BdSUS2, Bradi1g60320.1; BdSUS3, Bradi1g20890; BdSUS4, Bradi1g62960.1; BdSUS5, Bradi1g29570; BdSUS6,

Bradi3g60690; (5) Arabidopsis thaliana, AtSUS1, At5g20830; AtSUS2, At1g73370; AtSUS3, At4g02200; AtSUS4, At3g43160, AtSUS5, At5g49190; AtSUS6, At1g73370. El índice de

4.2.3. Análisis de expresión de los genes HvSs1, HvSs2, HvSs3, HvSs4.

En trabajos previos, la expresión de los genes HvSs1 y HvSs2 se había analizado electroforéticamente mediante Northern blot (Martinez de Ilarduya y col., 1993), y sus proteínas se habían caracterizado mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos (Guerin y Carbonero, 1997). Para ello, se diseñaron dos anticuerpos policlonales: el primero reconocía tanto SS1 como SS2, ya que se había obtenido inmunizando conejos frente a la proteína entera SS1 purificada de raíces, que comparte muchos epítopos idénticos con la isoforma SS2; el segundo únicamente reconocía a SS2, ya que se obtuvo inmunizando conejos utilizando el péptido sintético LANGSTDWNFV, que es específico de esta isoenzima. Así, se demostró que ambas enzimas se expresan de forma abundante en endospermo, donde se encontraron los cinco posibles homo- y heterotetrámeros [(SS1)4; (SS1)3SS2; (SS1)2(SS2)2; SS1

(SS2)3; (SS2)4]. En células de floema de hojas jóvenes y en raíces, únicamente

se encontraron homotetrámeros de SS1 (Guerin y Carbonero, 1997).

Para llevar a cabo un análisis exhaustivo de la expresión de los cuatro genes que codifican las distintas isoformas identificadas en cebada, una vez anotados los dos nuevos genes HvSs3 y HvSs4, se cuantificó su expresión mediante RT-qPCR. Esta técnica es mucho más sensible que la de Northern- blot utilizada con anterioridad, y además, en estos análisis, se incluyeron un mayor número de órganos y tejidos de cebada, como fueron: flores, endospermo y embrión en desarrollo (12 ddf), embrión maduro, embrión y aleurona en germinación (16 horas después de la imbibición, hdi), hojas y raíz. También se prestó especial atención a las cinéticas de expresión de estos genes durante la maduración y la germinación de la semilla, procesos fisiológicos en los que estas isozimas tendrían un papel muy importante y a los que se presta especial atención en este trabajo. En este caso, el material utilizado para llevar a cabo el análisis fue: endospermos aislados de semillas en desarrollo a 12, 14, 18, 22 y 26 ddf; y aleuronas aisladas de semillas en germinación a: 8, 16, 24 y 48 hdi. Todos los valores de expresión obtenidos se estandarizaron con respecto a la expresión del gen Actina2, del que se verificó

utilizado en trabajos previos para los mismos fines (Moreno-Risueno y col., 2007; Moreno-Risueno y col., 2008).

Los resultados obtenidos indicaron que mientras que HvSs1 se detectó prácticamente en todos los tejidos analizados, HvSs2 se expresó mayoritariamente en semillas durante la maduración y HvSs3 en embrión maduro. En endospermos en desarrollo a 14dap, los tránscritos más abundantes fueron los de HvSs1 y HvSs2 (≥3.000% del valor de Actina2), mientras que en embriones maduros fundamentalmente se detectó HvSs1 y HvSs3 (600 y 1.300% del valor de Actina2). El aleuronas en germinación, a 16 hdi, el tránscrito mayoritario fue HvSs1, con una expresión seis veces mayor que HvSs3, el segundo tránscrito con mayor expresión detectado en este tejido (≥3.500% de HvSs1 frente a 600% de HvSs3 del valor de Actina2). En hojas de plantas de 10 días, el nivel de expresión de HvSs1 y HvSs3 fue similar al del gen Actina2, y en las raíces de estas mismas plantas, la expresión mayoritaria fue la de HvSs1. Por el contrario, la expresión de HvSs4 fue casi indetectable en la mayoría de los tejidos analizados, con excepción de embrión maduro, aleuronas en germinación a 16 hdi y hojas, si bien en estos órganos nunca superó la expresión de, al menos, alguna de las otras isoformas (Figura 4.5).

Figura 4.5. Expresión global mediante RT-qPCR de los cuatro genes HvSs1, HvSs2,

HvSs3 y HvSs4. El material vegetal se recogió de flores (Fl); endospermo en desarrollo (dEn) y

embrión (dEm) 14 días después de la floración (ddf); embrión maduro (mEm), embrión en germinación (gEm) y aleurona (gAl) 16 horas después de la imbibición (hdi); hojas (Le) y raíz (Ro) de plántula con 10 días. La expresión se relativizó con respecto al gen Actina2. Los

En cuanto a los datos obtenidos cuando se analizó la cinética de expresión de los genes HvSs en endospermos en desarrollo 10, 14, 18, 22 y 26 ddf, indicaron que, como se había deducido de resultados anteriores, HvSs1 y HvSs2 se expresan de forma abundante en momentos tempranos de la maduración de la semilla. HvSs1 alcanza su máximo de expresión (5.000% del valor de Actina2) a los 18ddf, mientras que HvSs2 alcanza el máximo (3.000% del valor de Actina2) entre 10 y 14 ddf. La expresión de estos dos genes decae a lo largo de la maduración de la semilla, siendo la disminución de la expresión más acusada y rápida en el caso de HvSs2. A lo largo del desarrollo de la semilla también se han detectado tránscritos de HvSs3, con un máximo de expresión a los 22 ddf, sin embargo estos valores fueron 200 y 50 veces inferiores a los detectados para HvSs1 y HvSs2 en ese momento del desarrollo. Por último, el tránscrito de HvSs4 fue prácticamente indetectable en todos los momentos del desarrollo del endospermo analizados (Figura 4.6 a).

Los patrones de expresión en aleuronas aisladas de semillas en germinación, mostraron que el gen expresado mayoritariamente durante el proceso de germinación fue HvSs1 que alcanzó su máximo de expresión a las 24 hdi (4.000 % del valor de Actina2); el tránscrito de HvSs3 fue mucho menos abundante, aunque detectable, con un pico de expresión a las 16 hdi (600% del valor de Actina2). Sin embargo, tanto los tránscritos de HvSs2 como los de HvSs4 fueron prácticamente indetectables y su expresión no varió a lo largo de los diferentes estadios de germinación analizados (Figura 4.6 b).

Figura 4.6. Cinética de expresión mediante RT-qPCR de los cuatro genes HvSs1, HvSs2,

Hvss3 y HvSs4 durante la maduración y germinación de semillas. (a) Endospermos

recogidos a 10, 14, 18, 22 y 26 ddf. (b) Capas de aleurona de cebada a 8, 16, 24 y 48 hdi. La expresión se relativizó con respecto al gen Actina2. Los valores son la media ± SE de tres experimentos independientes.