Sobre la base de la eficiente acumulación de PMZ sobre la capa superficial de BCNT-dsDNA, se propone una nueva estrategia para la cuantificación del intercalador. Para ello se utilizó el paso de pre-concentración antes de la medición electroquímica siguiendo la estrategia de stripping de adsorción con cambio de medio para la determinación analítica de PMZ.
Se estudió la influencia del tiempo de acumulación (realizado a o.c.p.) en la respuesta por DPV de la PMZ pre-concentrada. La señal analítica utilizada fue la densidad de corriente del pico de oxidación de PMZ acumulada, la cual aumenta rápidamente con el tiempo de pre-concentración hasta 3 min y luego se mantiene constante. De esta manera, el tiempo seleccionado para la acumulación de PMZ fue de 5 min.
Figura 4.12. Curvas de calibrado de PMZ sobre GCE/BCNT-ssDNA () y GCE/BCNT-dsDNA () a partir de la densidad de corriente de pico (jp) de registros de DPV tomados luego de acumular
en soluciones de PMZ de concentración creciente. Los parámetros analíticos de los ajustes lineales (mostrados en las líneas rojas) se muestran en la tabla 4.3. GCE/BCNT-ssDNA: jp([PMZ])
= (0,031 0,002) [PMZ]. GCE/bCNT-dsDNA: jp([PMZ]) = (0,350 0,005) [PMZ] + (0,014 0,006).
La figura 4.12 muestra las curvas de calibración para PMZ obtenidas en buffer acetato 0,200 M pH 5,00 después de 5 min de interacción de GCE/BCNT-dsDNA (círculos llenos) y GCE/BCNT-ssDNA (círculos vacíos) con PMZ en concentraciones crecientes. La
tabla 4.3 muestra los parámetros analíticos obtenidos a partir de las curvas de calibrado para ambos bioelectrodos.
El aumento en la sensibilidad obtenida sobre GCE/BCNT-dsDNA en un orden de magnitud en comparación con GCE/BCNT-ssDNA confirma, una vez más, que la intercalación entre PMZ y el dsDNA le brinda a la plataforma importantes propiedades
0,00 2,00 4,00 6,00 0,0 0,8 1,6 2,4
j
p/m
A c
m
-2[PMZ]/
M
112
de acumulación. Esto se traduce en un mejor rendimiento analítico de GCE/BCNT- dsDNA, permitiendo la detección de PMZ a niveles de concentración nanomolares. Tabla 4.3. Parámetros analíticos para la cuantificación de PMZ, obtenidos del ajuste lineal de las curvas de calibrado para la determinación de PMZ de la figura 4.12.
Parámetro analítico GCE/BCNT-ssDNA GCE/BCNT-dsDNA
Sensibilidad/A M-1 cm-2 (3,1 0,2) x107 (3,50 0,05) x108
R2 a 0,95 0,998
Rango lineal/M 1,0 – 4,0 0,07 – 6,0
LOD/M b 0,34 0,023
a Coeficiente de correlación lineal; b El LOD (límite de detección) se calculó como
3,3/s, donde es la desviación estándar de la señal del blanco y s es la sensibilidad.
El biosensor GCE/BCNT-dsDNA fue empleado para la determinación de PMZ en una formulación farmacéutica de uso hospitalario (Prometazina Cevallos). El valor de la concentración de PMZ obtenido con el biosensor propuesto fue (51,30 ± 0,05) mg en 2 mL del inyectable mientras que el valor reportado por el laboratorio fabricante es de 50 mg de PMZ en 2mL. Por lo tanto, la metodología propuesta para la detección de PMZ no sólo se realiza de manera altamente sensible sino que también permite cuantificar al intercalador en muestras reales con un alto grado de exactitud (Error: 2,6 %).
La modificación de GCE con la dispersión de BCNT-dsDNA mejora la transferencia de carga de PMZ debido a dos efectos sinérgicos: por un lado, a las propiedades electrocatalíticas de BCNT y por el otro, a la interacción favorable de PMZ con dsDNA. El stripping de adsorción con cambio de medio demostró que la PMZ interactúa con la película de dsDNA soportada sobre BCNT principalmente mediante interacciones hidrofóbicas, a diferencia de la interacción electrostática con ssDNA. Mediciones espectroscópicas y cálculos de dinámica cuántica en el nivel de teoría de DFTB brindaron evidencias contundentes de las propiedades de PMZ como agente intercalador del dsDNA nativo, las cuales no habían sido analizadas de manera exhaustiva en bibliografía. Por otro lado, estos experimentos demostraron que el dsDNA que actúa como agente dispersante de los BCNT conserva su capacidad de interacción con un intercalador. Es importante destacar que este fenómeno ocurre a pesar de las drásticas condiciones a las que es sujeta la biomolécula durante el proceso de dispersión (sonicado durante 45 min en H2O:EtOH 50 %V/V).
113
Gracias a la fuerte interacción que se establece entre PMZ y la dispersión de BCNT con dsDNA soportada sobre GCE, se pudo pre-concentrar de manera eficiente el intercalador, lo que brindó una nueva estrategia de cuantificación altamente sensible de la PMZ hasta niveles nanomolares y posibilita su determinación en muestras reales.
[1] V. Luzzati, F. Masson, L.S. Lerman, Interaction of DNA and proflavine: A small-angle X-ray scattering study, J. Mol. Biol. 3 (1961) 634–639.
[2] L.S. Lerman, Structural considerations in the interaction of DNA and acridines, J. Mol. Biol. 3 (1961) 18–IN14.
[3] A. Mukherjee, W.D. Sasikala, Drug-DNA Intercalation: From Discovery to the Molecular Mechanism, in: T.K.-C.B.T.-A. in P.C. and S. Biology (Ed.), Dyn. Proteins Nucleic Acids, Academic Press, 2013: pp. 1–62.
[4] R. Lavery, Multiple Aspects of DNA and RNA: From Biophysics to Bioinformatics, École D’ÉtÉ de Physics des Houches Session LXXXII, Elsevier, 2005.
[5] A. Rescifina, C. Zagni, M.G. Varrica, V. Pistarà, A. Corsaro, Recent advances in small organic molecules as DNA intercalating agents: Synthesis, activity, and modeling, Eur. J. Med. Chem. 74 (2014) 95–115.
[6] N.J. Wheate, C.R. Brodie, J.G. Collins, S. Kemp, J.R. Aldrich-Wright, DNA Intercalators in Cancer Therapy: Organic and Inorganic Drugs and Their Spectroscopic Tools of Analysis, Mini Rev. Med. Chem. 7 (2007) 627–648.
[7] H.-K. Liu, P.J. Sadler, Metal Complexes as DNA Intercalators, Acc. Chem. Res. 44 (2011) 349–359.
[8] E. Palecek, M. Fojta, M. Tomschik, J. Wang, Electrochemical biosensors for DNA hybridization and DNA damage., Biosens. Bioelectron. 13 (1998) 621–628.
[9] E. Paleček, M. Bartošík, Electrochemistry of Nucleic Acids, Chem. Rev. 112 (2012) 3427– 3481.
[10] D. Kato, O. Niwa, Carbon-based electrode materials for DNA electroanalysis., Anal. Sci. 29 (2013) 385–392.
[11] M. Fojta, Electrochemical sensors for DNA interactions and damage, Electroanalysis. 14 (2002) 1449–1463.
[12] R.L. Zaffino, T. Galan, W.A. Pardo, M. Mir, J. Samitier, Nanoprobes for enhanced
electrochemical DNA sensors, Wiley Interdiscip. Rev. Nanomedicine Nanobiotechnology. 7 (2015) 817–827.
[13] T. Wang, R. Zhu, J. Zhuo, Z. Zhu, Y. Shao, M. Li, Direct Detection of DNA below ppb Level Based on Thionin- Functionalized Layered MoS 2 Electrochemical Sensors, (2014). [14] S. Sato, M. Tsueda, S. Takenaka, Electrochemical detection of aberrant methylated gene
using naphthalene diimide derivative carrying four ferrocene moieties, J. Organomet. Chem. 695 (2010) 1858–1862.
[15] M.Y. Wei, L.H. Guo, P. Famouri, DNA biosensors based on metallo-intercalator probes and electrocatalytic amplification, Microchim. Acta. 172 (2011) 247–260.
[16] B. Blankert, H. Hayen, S.M. Van Leeuwen, U. Karst, E. Bodoki, S. Lotrean, et al.,
Electrochemical, chemical and enzymatic oxidations of phenothiazines, Electroanalysis. 17 (2005) 1501–1510.
114
macromolecules and effects in bacterial mutagenicity tests of the radical cation of promethazine and photoactivated promethazine. Comparison with chlorpromazine, Chem. Biol. Interact. 57 (1986) 73–83.
[18] E. Gocke, Review of the genotoxic properties of chlorpromazine and related phenothiazines, Mutat. Res. - Rev. Genet. Toxicol. 366 (1996) 9–21.
[19] K. Stolze, R.P. Mason, ESR spectroscopy of flow-oriented cation radicals of phenothiazine derivatives and phenoxathiin intercalated in DNA, Chem. Biol. Interact. 77 (1991) 283– 289.
[20] J. Zhong, Z. Qi, H. Dai, C. Fan, G. Li, N. Matsuda, Sensing phenothiazine drugs at a gold electrode co-modified with DNA and gold nanoparticles., Anal. Sci. 19 (2003) 653–657. [21] J. Wang, G. Rivas, X. Cai, H. Shiraishi, P.A.M. Farias, N. Dontha, et al., Accumulation and trace measurements of phenothiazine drugs at DNA-modified electrodes, Anal. Chim. Acta. 332 (1996) 139–144.
[22] F.W.P. Ribeiro, A.S. Cardoso, R.R. Portela, J.E.S. Lima, S.A.S. Machado, P. De Lima-Neto, et al., Electroanalytical determination of promethazine hydrochloride in pharmaceutical formulations on highly boron-doped diamond electrodes using square-wave adsorptive voltammetry, Electroanalysis. 20 (2008) 2031–2039.
[23] Z.-S. Yang, J. Zhao, D.-P. Zhang, Y.-C. Liu, Electrochemical determination of trace promethazine hydrochloride by a pretreated glassy carbon electrode modified with DNA., Anal. Sci. 23 (2007) 569–572.
[24] J.P. Marco, K.B. Borges, C.R.T. Tarley, E.S. Ribeiro, A.C. Pereira, Development of a simple, rapid and validated square wave voltametric method for determination of promethazine in raw material and pharmaceutical formulation using DNA modified multiwall carbon nanotube paste electrode, Sensors Actuators B Chem. 177 (2013) 251–259.
[25] H. Tang, J. Chen, K. Cui, L. Nie, Y. Kuang, S. Yao, Immobilization and electro-oxidation of calf thymus deoxyribonucleic acid at alkylamine modified carbon nanotube electrode and its interaction with promethazine hydrochloride, J. Electroanal. Chem. 587 (2006) 269–275.
[26] M. Elstner, P. Hobza, T. Frauenheim, S. Suhai, E. Kaxiras, Hydrogen bonding and stacking interactions of nucleic acid base pairs: A density-functional-theory based treatment, J. Chem. Phys. 114 (2001).
[27] M. Elstner, D. Porezag, G. Jungnickel, J. Elsner, M. Haugk, T. Frauenheim, et al., Self- consistent-charge density-functional tight-binding method for simulations of complex materials properties, Phys. Rev. B. 58 (1998) 7260–7268.
[28] B. Aradi, B. Hourahine, T. Frauenheim, DFTB+, a Sparse Matrix-Based Implementation of the DFTB Method, J. Phys. Chem. A. 111 (2007) 5678–5684.
[29] T.A. Niehaus, M. Elstner, T. Frauenheim, S. Suhai, Application of an approximate density- functional method to sulfur containing compounds, J. Mol. Struct. THEOCHEM. 541 (2001) 185–194.
[30] M. Gaus, Q. Cui, M. Elstner, DFTB3: Extension of the Self-Consistent-Charge Density- Functional Tight-Binding Method (SCC-DFTB), J. Chem. Theory Comput. 7 (2011) 931–948. [31] M.B. Oviedo, C.F.A. Negre, C.G. Sánchez, Dynamical simulation of the optical response of
photosynthetic pigments., Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (2010) 6706–6711.
[32] V.C.F. and C.F.A.N. and M.B.O. and F.P.B. and F.Y.O. and C.G. Sánchez, A theoretical study of the optical properties of nanostructured TiO2, J. Phys. Condens. Matter. 25 (2013) 115304.
[33] C.F.A. Negre, V.C. Fuertes, M.B. Oviedo, F.Y. Oliva, C.G. Sánchez, Quantum Dynamics of Light-Induced Charge Injection in a Model Dye–Nanoparticle Complex, J. Phys. Chem. C. 116 (2012) 14748–14753.
115
[34] M.B. Oviedo, C.G. Sánchez, Transition Dipole Moments of the Qy Band in Photosynthetic Pigments, J. Phys. Chem. A. 115 (2011) 12280–12285.
[35] M.B. Oviedo, X. Zarate, C.F.A. Negre, E. Schott, R. Arratia-Pérez, C.G. Sánchez, Quantum Dynamical Simulations as a Tool for Predicting Photoinjection Mechanisms in Dye- Sensitized TiO2 Solar Cells, J. Phys. Chem. Lett. 3 (2012) 2548–2555.
[36] Y. Dai, B. Chakraborty, B. Ge, H.-Z. Yu, Adenosine-Triggered Elimination of Methylene Blue Noncovalently Bound to Immobilized Functional dsDNA-Aptamer Constructs, J. Phys. Chem. B. 116 (2012) 6361–6368.
[37] S. Khezrian, A. Salimi, H. Teymourian, R. Hallaj, Label-free electrochemical IgE aptasensor based on covalent attachment of aptamer onto multiwalled carbon nanotubes/ionic liquid/chitosan nanocomposite modified electrode, Biosens. Bioelectron. 43 (2013) 218–225.
[38] D. Voet, W.B. Gratzer, R.A. Cox, P. Doty, Absorption spectra of nucleotides,
polynucleotides, and nucleic acids in the far ultraviolet, Biopolymers. 1 (1963) 193–208. [39] M.J. Frisch, G.W. Trucks, H.B. Schlegel, G.E. Scuseria, M.A. Robb, J.R. Cheeseman, et al.,
Gaussian 09 (Revision D.01), (2009).
[40] J. Lang, M. Liu, Layer-by-Layer Assembly of DNA Films and Their Interactions with Dyes, J. Phys. Chem. B. 103 (1999) 11393–11397.
[41] D. Suh, J.B. Chaires, Criteria for the mode of binding of DNA binding agents, Bioorg. Med. Chem. 3 (1995) 723–728.
[42] L. Pérez-Flores, A.J. Ruiz-Chica, J.G. Delcros, F. Sánchez-Jiménez, F.J. Ramírez,
Intercalation and groove binding of an acridine–spermine conjugate on DNA sequences: an FT–Raman and UV–visible absorption study, J. Mol. Struct. 744–747 (2005) 699–704. [43] J. Li, A. Cassell, L. Delzeit, J. Han, M. Meyyappan, Novel Three-Dimensional Electrodes:
Electrochemical Properties of Carbon Nanotube Ensembles, J. Phys. Chem. B. 106 (2002) 9299–9305.
[44] H.J. Zheng, A.M. Yu, C.A. Ma, Effect of pore characteristics on electrochemical capacitance of activated carbons, Russ. J. Electrochem. 48 (2012) 1179–1186. [45] P. Simon, a Burke, Nanostructured carbons: Double-layer capacitance and more,
Electrochem. Soc. Interface. 17 (2008) 38–43.
[46] A.J. Bard, L.R. Faulkner, Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, Wiley, New York, 2001.
[47] A.L. Eckermann, D.J. Feld, J.A. Shaw, T.J. Meade, Electrochemistry of redox-active self- assembled monolayers, Coord. Chem. Rev. 254 (2010) 1769–1802.