Determinacy and Consistency

ARTÍCULO 1: “From Dinophysis spp toxicity to DSP outbreaks: a preliminary model of toxin accumulation in mussels.”

En el trabajo que se muestra en el artículo 1 se analizaron mediante HPLC-FD arrastres multiespecíficos de la Ría de Pontevedra ricos en Dinophysis y se estimaron, mediante un análisis de regresión multiple, los contenidos de ácido okadaico y análogos de las diferentes especies de Dinophysis presentes en dichos arrastres por medio de la relación entre la abundancia de las mismas en el plancton y las concentraciones detectadas de dichas toxinas. Asimismo, se desarrolló un modelo preliminar de acumulación de toxinas en los mejillones para predecir el impacto de Dinophysis en la toxicidad de los mismos. El modelo se basó en los principales parámetros de la fisiología nutricional de los mejillones, simulando el potencial tóxico como una función de las células tóxicas, de la materia particulada (seston) en el mar y de las tasas de filtración y detoxificación.

Resultados y discusión:

Los resultados del análisis cromatográfico mostraron que el ácido okadaico fue la toxina predominante en la mayoría de las muestras. En más de la mitad de los arrastres fitoplanctónicos se observó un segundo pico próximo al correspondiente al AO, que se asignó a la dinophysistoxina 2 (DTX2) - previamente identificada en mejillón irlandés- al comprobarse que presentaba un comportamiento cromatográfico idéntico al encontrado en los extractos del citado mejillón de Irlanda. No se detectó DTX1 en ninguno de los arrastres.

Dinophysis acuta y D. acuminata estaban presentes en todas las muestras en las que

apareció el ácido okadaico y el pico asignable a la DTX2. La especial relación entre D. acuta y esta última toxina se hizo evidente durante una proliferación inusual de esta especie en diciembre de 1992, sugiriendo que D. acuta es la principal productora de DTX2 en el área y que puede alcanzar concentraciones considerables en el plancton.

Los trabajos realizados hasta la fecha en relación a la toxicidad DSP de los mejillones y de las células de Dinophysis de las Rías Gallegas habían confirmado la presencia de AO (Kumagai et al. 1986, Rodríguez Vázquez et al., 1989, Gago et al., 1993, Lee et al., 1989a). Sin embargo, los resultados de este trabajo muestran la prácticamente segura presencia en

Dinophysis de una segunda toxina, la DTX2. Adicionalmente se mostró que la DTX1,

1995; Lee et al., 1989a; Suzuki et al., 1997, Tangen et al., 1983; Krogh et al., 1985), no lo está en Galicia y que su presencia en el plancton resulta despreciable.

En las muestras en las que únicamente D. acuminata y el AO estaban presentes, se estimó un máximo de contenido en toxina de 7.2 pg cel-1. Los resultados del análisis de regresión múltiple mostraron a D. acuminata, D. acuta y D. rotundata como los principales agentes productores de toxinas DSP, en tanto que no se obtuvo correlación entre la presencia de AO y DTX2 con la presencia de D. caudata y D. sacculus en el plancton.

La estimación del contenido medio de AO por célula de D. acuminata, 6 pg AO cel-1, fue próximo al obtenido por Lee et al. (1989) con células obtenidas por micromanipulación. En el caso de D. acuta, se estimaron dos valores mucho más altos que los documentados previamente (Lee et al., 1989 a) en células correspondientes a una ocurrencia inusual de esta especie en diciembre. Estos valores podrían explicarse considerando que esta proliferación fuera debida a una introducción tardía de aguas de la plataforma en las rías (fenómeno común a principios de otoño), y suponiendo que esta población tardía de D. acuta estuviera formada por células adultas de crecimiento lento, en el último periodo de la fase exponencial o ya en fase estacionaria, fases en las que para las que en el caso de Prorocentrum lima, otra especie de dinoflagelado productora de toxinas DSP se han documentado los contenidos máximos de toxinas.

Los resultados obtenidos para D. rotundata difieren de los encontrados por Cembella

et al. (1989) y Masselin et al. (1992) que consideraron esta especie como no tóxica y de los de

Lee et al., (1989) que, en contraste, mostraron un contenido de 101 pg cel-1 de DTX1 para esta especie.

La acumulación de toxicidad puede predecirse adecuadamente por medio de un modelo sencillo de acumulación que utiliza como entradas la concentración de células de

Dinophysis en el mar y el contenido en toxinas de sus células. La concordancia entre los

cierres del mercado reales y los obtenidos a partir del modelo fue buena cuando se utilizó la concentración de Dinophysis en el agua y el valor medio de contenido de toxinas obtenido a partir del análisis de regresión, aunque, sorprendentemente, resultó más pobre cuando se utilizó el contenido en toxinas por célula obtenida del análisis por HPLC de las muestras de los arrastres.

Si bien el comportamiento y la eficiencia nutricional de los mejillones parecen estar afectados por varias variables medioambientales, entre las que la concentración y el contenido en materia orgánica del seston son consideradas las más importante (Bayne et al., 1983; 1987), el modelo preliminar presentado en este trabajo, a pesar de su simplificación, encaja

razonablemente bien con los datos reales. Éste es el primer modelo de acumulación de toxinas DSP y apoya la idea de que la incorporación de parámetros fisiológicos de los bivalvos es esencial a la hora de predecir y modelar el impacto del fitoplancton tóxico en la toxicidad de los mismos.

ARTICULO 2: “Toxin content of Dinophysis acuminata, D. acuta and D. caudata from the Galician Rías Bajas”.

En este artículo se presentan los resultados relativos al perfil y contenido de toxinas por célula de D. acuminata, D. acuta y D. caudata aisladas por micromanipulación a partir de arrastres de red de poblaciones naturales fitoplanctónicas multiespecíficas recogidas durante episodios de DSP en las Rías de Pontevedra y Vigo en la primavera y otoño de 1997 y 1998. Adicionalmente, en las muestras de D. acuminata de junio de 1998, se realizaron estudios preliminares para la estimación indirecta de los diol ésteres y DTX4 en células aisladas individualmente, calculando la diferencia de niveles de AO entre células sometidas a un proceso de inactivación enzimática y células de la misma población en las que sí se permitió la hidrólisis.

Resultados y discusión:

Se detectó AO en todas las muestras de Dinophysis acuminata. En las muestras de junio de 1998, sometidas a dos tipos de extracción, no se observaron diferencias significativas en los resultados que pudieran indicar la presencia mayoritaria de formas conjugadas del AO en las células analizadas (9.9 pg cel-1en la muestra sometida a hidrólisis enzimática y 7.9 pg cel-1

en la muestra en la que se evitaron transformaciones enzimáticas). Se observa un minúsculo pico con un tiempo de retención similar al de la DTX2.

En lo que respecta a Dinophysis acuta, se detectó AO y DTX2 en las tres muestras analizadas. En las dos primeras muestras la proporción AO: DTX2 fue aproximadamente 3:2.

En el caso de Dinophysis caudata, se observó en el cromatograma un pico muy pequeño con el mismo tiempo de retención que el AO que podría interpretarse como trazas de AO (~ 0.7 pg cel-1).

En estos resultados preliminares se establece y confirma por primera vez la presencia de DTX2 en D. acuta de las Rías Bajas Gallegas, ya observada en los trabajos mostrados en el artículo 1 (Blanco et al., 1995), en los que se detectaron picos con comportamiento cromatográfico idéntico a la DTX2 en los análisis de arrastres fitoplanctónicos que sugirieron que la aparición de este compuesto estaba asociada con la ocurrencia de D. acuta.

Posteriormente, Gago et al. (1996) y Vale y Sampayo (1996) confirmaron la presencia de DTX2 en mejillón de Galicia y Portugal respectivamente. Asimismo, Vale y Sampayo (1998) correlacionaron la aparición de DTX2 en bivalvos portugueses con la ocurrencia de D. acuta. James et al (1998) identificaron mediante HPLC-MS que la DTX2 es la toxina predominante en D. acuta en Irlanda en una proporción de AO: DTX2 de aproximadamente 3:2 que, curiosamente, coincidía con la observada por Blanco et al. (1995) en los análisis de arrastres de poblaciones naturales multiespecíficas entre las que se incluía D. acuta. De igual forma, los resultados obtenidos en este trabajo confirmaron las estimaciones previas de Blanco et al. (1995) en relación a que la DTX2 puede constituir hasta un 40% del total de toxinas.

Todo lo anterior no tiene trascendencia en lo que respecta al control sanitario realizado mediante bioensayo en ratón, que estima el efecto biológico del conjunto de toxinas diarreicas, pero si podría tenerla en el caso de la utilización de métodos alternativos que no fueran muy sensibles a la detección de esta toxina.

La presencia de cantidades traza de AO en una única muestra analizada de D. caudata de septiembre de 1997, sugiere su capacidad para biosintetizar toxinas aunque al tratarse de una sola muestra se requiere confirmación de este resultado en futuros análisis. No obstante, en el trabajo que se muestra en el artículo 1 (Blanco et al., 1995) en el que se aplicó análisis de regresión múltiple a los resultados de concentración de toxinas de arrastres fitoplanctónicos se sugiere ya que esta especie, debía contribuir poco o nada a la toxicidad global obtenida.

El contenido de toxinas por célula parece estar influenciado tanto por la cepa que desarrolla mayoritariamente el episodio como por las condiciones en las que se encuentran las células en la proliferación. En relación con el primer aspecto, cabe destacar que, en

Dinophysis acuminata, las muestras de septiembre presentan un contenido celular en toxinas

dos veces superior a la de junio (21.7 pg cel-1). En relación con el segundo aspecto, se observó que Dinophysis acuta presentó importantes diferencias cuantitativas entre las muestras de arrastres mantenidos en el laboratorio 5 y 9 días (55.1 y 24.1 pg cel-1) y la muestras resultantes de los aislamientos de células realizados el mismo día de recogida del arrastre (10.7 pg cel-1_).

El contenido en toxinas de las células aumentó durante 5 días de mantenimiento en el laboratorio, estimándose una tasa de producción de toxina por célula en 0.33 dia-1_{. Tras 7 días,}

sin embargo, se produjo un descenso. Una posible explicación sería que la tasa de división celular fue muy reducida (quizás por las manipulaciones del arrastre, o debido a condiciones subóptimas en las cámaras de cultivo), mientras que continuaba la síntesis de toxinas DSP. El

descenso de toxina por célula obtenido tras 7 días de mantenimiento artificial revelaría el principio del decaimiento del arrastre.

Los resultados previos sobre la estimación de contenido en toxinas de células de

Dinophysis spp habían puesto de manifiesto una gran variabilidad en los valores obtenidos

para cada especie en distintas zonas del mundo o incluso en la misma localidad (Lee et al., 1989a; Subba Rao et al., 1993; Andersen et al., 1996; Johansson et al., 1996; Sato et al., 1996; Suzuki et al., 1997). Al no disponerse de cultivos de estas especies, resulta difícil determinar si esta variabilidad se debe a que estamos trabajando con cepas distintas de toxicidad muy diversa o si se trata de las mismas cepas respondiendo a distintas condiciones ambientales o poblaciones con distinta tasa de crecimiento y biovolumen. En el caso del complejo D. acuminata, el problema se complica por la gran variabilidad morfológica, o plasticidad, que presenta esta especie. Es necesario, pues, obtener repetidas estimaciones de toxicidad por célula en series temporales durante distintas estaciones del año, y relacionar estos valores con el tamaño/forma de las células, y aún mejor, acompañar estos estudios de otros que determinen la variabilidad genética de las células procedentes de distintos episodios.

ARTICULO 3: “Toxin composition of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima