Objections and Replies

Los moluscos acumulan toxinas principalmente por filtración directa de las células productoras de las mismas o alimentándose de organismos contaminados, como es el caso de algunos moluscos gasterópodos. En los bivalvos, la alimentación implica varios procesos. Primero, la actividad de las branquias fuerza el flujo del agua a través de ellas de tal manera que la mayor parte de las partículas son retenidas. Seguidamente éstas son transportadas a la boca tras un proceso de selección (selección pre-ingestiva) en el que aquellas que el sistema no es capaz de retener o que son rechazadas por sus características físicas (como la densidad ó el sabor) pueden ser excluidas.

Una vez que las toxinas han sido ingeridas, pueden ser absorbidas y acumuladas como tal o transformadas. Los trabajos que forman parte de esta tesis doctoral muestran cómo estas transformaciones pueden dar lugar a un espectro complejo de compuestos de distintas polaridades y con diversas eficiencias de absorción y velocidad de eliminación, probablemente en función de su diferente capacidad para atravesar las membranas celulares. Con frecuencia, los compuestos generados poseen una toxicidad diferente a la de la toxina original, modificándose de esta manera la toxicidad del organismo que produce o acumula las toxinas sin que tenga lugar ningún proceso de adquisición o pérdida de la misma. El hecho de que la polaridad de las toxinas transformadas pueda ser diferente de la de las toxinas originales ocasiona que haya que utilizar diferentes protocolos de extracción a efectos de su detección.

5.3.1. Transformaciones en el grupo del AO y derivados

Hasta la fecha se han documentado 3 tipos de transformaciones para las toxinas del grupo del ácido okadaico: a) Hidrólisis de las formas conjugadas: compuestos tipo DTX4, DTX5 y diol ésteres, b) oxidación de diol-ésteres y c) acilación de las toxinas con el ácido carboxílico libre.

a) Hidrólisis de las formas conjugadas

El estrés celular inherente a la retención, ingestión y disrupción mecánica implicado en la adquisición y digestión de nutrientes por parte de los moluscos puede desencadenar procesos autolíticos de las especies productoras de toxinas y/o liberar sustancias de otras

especies del fitoplancton ingerido capaces de hidrolizar las toxinas más probables en el fitoplancton, esto es DTX4, DTX5 y compuestos relacionados, a diol-esteres y otros derivados (Windust et al. 1997). Las esterasas que intervienen en la digestión efectúan muy probablemente el mismo proceso hidrolítico sobre las toxinas que sobre los alimentos, para dar lugar, al menos en parte, a las toxinas con el grupo carboxílico libre: AO, DTX2, etc.

Se ha sugerido que la DTX4 y la DTX5 son productos de novo mayoritarios de

Prorocentrum lima y que el AO y los diol-esteres se obtendrían únicamente como productos

de la hidrólisis de las toxinas sulfatadas (Hu et al., 1995 a; 1995b; Bauder et al., 1996; Windust et al., 2000). DTX4 y DTX5 son compuestos dotados de cierta polaridad debido a los grupos sulfatos que contienen y son sólo parcialmente solubles en cloroformo (Hu et al., 1995a) y hexano. Son rápidamente hidrolizados a diol-esteres (en segundos) y a AO (horas) por la acción de enzimas autolíticas de las células que las contienen (Bauder et al., 1996; Windust et al., 2000) y probablemente también por la actividad de las enzimas del tracto digestivo de las organismos que se alimentan de dinoflagelados tóxicos. Todas estas circunstancias han sido probablemente la causa de que estas toxinas hayan pasado inadvertidas en muchos estudios en los que la hidrólisis y la partición líquido-líquido no estaban especialmente diseñadas para su detección. Asímismo, los procesos asociados a la manipulación y tratamiento de las muestras han podido en muchos estudios desencadenar procesos de hidrólisis que han dado lugar a la falsa interpretación de que las toxinas mayoritariamente presentes en fitoplancton son aquellas con el grupo del ácido carboxílico libre. Estudios más recientes, entre los que se incluyen contribuciones de la presente tesis doctoral (Moroño et al., 2003; Fernández et al., 2006) y que no presentan estas limitaciones técnicas, sugieren que este tipo de compuestos sulfatados son también importantes en el caso de Dinophysis (Vale and Sampayo, 1999, Mackenzie et al., 2002; Vale and Sampayo, 2002 b, Moroño et al., 2003) y que también son metabolizados de diversas maneras por diferentes organismos invertebrados (Vale and Sampayo, 2002b).

Los diol-ésteres producidos por la hidrólisis de DTX4 y DTX5 son menos polares, capaces de traspasar muy fácilmente las membranas celulares (Windust et al. 1996; 2000) y susceptibles de ser oxidados. Los diolésteres y sus derivados oxidados pueden ser también hidrolizados dando lugar a las principales toxinas tanto por la acción de las enzimas presentes en las células cuando se produce su ruptura (Windust et al., 2000) como por la de esterasas inespecíficas durante el proceso de digestión en los bivalvos (Hu et al., 1999). Diferentes estudios han mostrado que la capacidad hidrolítica depende de la especie de bivalvo. En la

vieira Argopecten irradians las formas dominantes de las toxinas DSP después de haber sido alimentada con Prorocentrum lima fueron los diol ésteres del AO en una proporción similar a la encontrada en las células del dinoflagelado lo que sugiere la ausencia de actividad de las esterasas durante el proceso digestivo (Bauder et al., 2001). Una situación similar se encontró en 5 de 6 bivalvos estudiados en Portugal, almejas (Venerupis pullastra y Ruditapes

decussatus), ostiones (Crassostrea japonica), berberechos (Cerastoderma edule) y navajas

(Solen marginatus), que mostraron escasa capacidad para hidrolizar los ésteres del AO ya que aproximadamente el 100% de ellos mantenían su funcionalización. Sin embargo, en otra de las especies estudiadas, el mejillón Mytilus galloprovincialis, alrededor del 50 % de la toxinas se encontró en la forma carboxílica (Vale and Sampayo, 2002b). En otra especie de mejillón,

Perna canaliculus, se detectó una cantidad de ésteres de AO inferior a la cantidad presente en

el fitoplancton utilizado para su alimentación (MacKenzie et al., 2002), apoyando este hecho la idea de que los mejillones poseen una capacidad hidrolítica mayor que otras especies de bivalvos.

b) Oxidación:

En el caso de la diatomea Thalassiosira weissflogii se han demostrado procesos oxidativos sobre los diol ésteres que sólo afectan al radical diol dando lugar a diferentes compuestos que son más polares que la toxina original (Bauder et al., 1996; Hu et al., 1999, Windust et al., 2000). Este proceso ha sido documentado para el AO pero probablemente es también aplicable a DTX1 y DTX2. Diversas enzimas tales como citocromo P-450 pueden intervenir en estos procesos (Windust et al., 2000). Transformaciones similares podrían tener lugar en lo moluscos ya que los procesos oxidativos son importantes componentes de la estrategia de defensa contra parásitos y xenobióticos.

c) Acilación

El grupo hidroxilo del C7 de la molécula del AO y análogos, y posiblemente el del C23, pueden estar esterificados con ácido grasos de diferente longitud, dando lugar a toda una serie de compuestos que son menos polares que las toxinas originales y generícamente denominados “DTX3” (Yasumoto, 1985). Esta acilación fue demostrada para la DTX1 en el caso de la vieira Patinopecten yessoensis (Suzuki et al., 1999) y muy probablemente tiene lugar también en otros bivalvos (ya que estos compuestos han sido detectados en moluscos pero no en fitoplancton) y para las otras dos toxinas principales del grupo DSP, esto es el AO y la DTX2 (Marr et al., 1992; Carmody et al., 1995a). Estudios que forman parte de esta tesis

doctoral se han centrado en derivados de baja polaridad de las principales toxinas DSP (no estrictamente en 7-O-Acil derivados) que probablemente incluyen otros derivados tales como diol ésteres (Fernandez et al., 1998; Vale and Sampayo, 1999, 2002 b; Moroño et al., 2003). Algunos de estos estudios han sido capaces de discriminar diferentes clases de compuestos a través del modelado matemático y de estimar tasas de acilación en el caso de la especie de mejillón Mytilus galloprovincialis (Blanco et al., 1999; Moroño et al., 2003).

No existen evidencias de interconversión entre las tres toxinas principales AO, DTX1 y DTX2 así como en el caso del ácido 7-deoxi-okadaico, y la información obtenida hasta la fecha indica que no tienen lugar estas transformaciones.

5.3.2. Transformaciones de las Pectenotoxinas en los moluscos

En el caso de las pectenotoxinas existen tres vías principales de transformaciones: a) oxidación, b) apertura del enlace C1-C33 con la consecuente ruptura del anillo de lactona y c) acilación de los secoácidos.

a) Oxidación

En lo que respecta a la oxidación, se asumió en un principio que la principal pectenotoxina presente en el plancton era la PTX2 y que este compuesto sufría en los bivalvos toda una serie de transformaciones que daban lugar finalmente a PTX6, con PTX1 y PTX3 como pasos intermedios, como se pudo observar en Patinopecten yessoensis (Murata and Yasumoto, 1990; Suzuki et al., 1998). Sin embargo, PTX6 no ha sido detectada en el mejillón

Mytilus galloprovincialis recogido en la misma área que las vieiras que acumulan esta toxina

(Suzuki and Yasumoto, 2000) lo que sugiere que el proceso de oxidación requerido es dependiente de las características enzimáticas o bioquímicas de cada especie de bivalvo. b) Ruptura del enlace C1-C33

La segunda vía de transformación de las pectenotoxinas es la apertura de la lactona por hidrólisis de la lactona C1-C33 convirtiendo las pectenotoxinas en los secoácidos correspondientes (Fig. 4).

Este tipo de transformación es el que parece tener lugar preferentemente en el caso de

Pecten novaezelandiae, Perna canaliculus (Suzuki et al., 2001 b, c) y muy posiblemente en el

de Mytilus galloprovincialis, como se muestra en uno de los trabajos que constituyen esta tesis doctoral (Fernández et al., 2003a).

Figura 4.- Transformación de Pectenotoxinas en sus correspondientes seco-ácidos.

c) Acilación

El proceso de acilación de los secoácidos de la PTX2 ha sido descrito en mejillón (Mytilus edulis). Así, Wilkins et al. (2006) detectaron hasta tres series de ésteres de ácidos grasos del secoácido de la PTX2 y de 7-epi-PTX-2 SA. Los 37-O-Acil- ésteres del secoácido de la PTX2 fueron los más abundantes, seguidos de los correspondientes 11-O-Acil- ésteres.

Otras transformaciones inducidas por el calentamiento o tratamientos químicos pueden tener lugar y han sido descritas por Burguess and Shaw (2001).

5.3.3. Yesotoxinas

Prácticamente no existe información disponible sobre las transformaciones de las yessotoxinas. Se ha encontrado que la yesotoxina puede ser transformada en 45 OH-YTX por la acción de los mejillones Perna canaliculus (MacKenzie et al., 2002) y Mytilus

galloprovincialis (Suzuki and Mitsuya, 2001 a), pero con una eficiencia mayor en la segunda

especie, en la que el 90 % de la YTX del alimento fue convertida a 45 OH-YTX. Perna

canaliculus transformó menos del 10 %. En esta especie se detectaron diversos compuestos OH 18 11 37 18 37 11

relacionados, probablemente metabolitos de YTX no identificados hasta la fecha (MacKenzie

et al., 2002).

5.4. Compartimentalización

La distribución de las toxinas DSP en los diferentes órganos y tejidos de los moluscos ha sido estudiada de forma esporádica. Los primeros estudios coinciden en señalar que este tipo de toxinas se acumulan principalmente en las glándulas digestivas (Yasumoto et al., 1978; 1979), lo que parece ser la situación más frecuente como se ha observado en mejillones (Mytilus edulis) (Pillet et al., 1995; Stabell et al., 1992) y en los pectínidos Argopecten

irradians (Bauder et al., 2001) y Pecten maximus (Hess et al., 2003). Sin embargo, esta

conclusión queda matizada por los resultados de Bauder et al (2001) que mostraron que las vísceras (principalmente las glándulas digestivas) de Argopecten irradians depuraban las toxinas DSP con mucha más lentitud que el resto de los tejidos, por lo que en ellas había mayor acumulación de toxina. De hecho en el caso de A. irradians, el porcentaje de toxina aumentó hasta un 95% tras dos días de depuración.

5.5. Eliminación

Los moluscos no retienen las toxinas indefinidamente, de manera que, transcurrido cierto tiempo desde la interrupción de la ingestión de células tóxicas, el contenido de toxinas se hace indetectable. Dado que la mayor parte de los programas de control usan o han usado hasta el pasado muy reciente el bioensayo en ratón para la detección de las toxinas, las tasas de depuración han sido estudiadas desde la perspectiva de la eliminación de la toxicidad más que desde el punto de vista de la eliminación de las toxinas propiamente dichas. En situaciones simples, en las que sólo aparecen una o varias toxinas con tasas de depuración y potencia tóxica similar, la eliminación de toxicidad transcurre en paralelo con la eliminación de toxinas. Sin embargo, en casos más complejos, la eliminación de la toxicidad tiene una correlación pobre con la eliminación de cada una de las toxinas específicas. Las diferentes especies de moluscos depuran la toxicidad DSP, y concretamente el AO (la más estudiada de este grupo de toxinas), con velocidades de depuración diferentes.

Si bien existe una variabilidad notable entre especies, no parece que las diferencias sean tan grandes como las observadas en otros grupos de biotoxinas marinas. No existen registros de especies con un tiempo de retención tan largo como el de Saxidomus giganteus para las toxinas PSP (Kitts et al., 1992), ó como Pecten maximus (Blanco et al., 2002a) y Siliqua

especies que depuren este tipo de toxinas tan rápido como lo hacen los mitílidos con el ácido domoico, como es el caso de Perna canaliculus ,1.97día-1 (MacKenzie et al., 1993), Mytilus

californianus, 0.34-0.55 día-1, (Whyte et al., 1995), M. edulis ,0.49-0.99 día-1, (Novaczek et

al., 1992), 2.01-10.59 día-1 en experimentos de 1 ó 2 horas (Novaczek et al., 1991), 10.59 y 2.2 dia-1 en experimentos de 2 y 24 horas respectivamente (Wohlgeschaffen et al., 1992) y M.

galloprovincialis, 0.40-0.58 dia-1 (Blanco et al., 2002b).

Las diferentes toxinas son eliminadas a diferentes velocidades. La DTX2 y sus derivados de baja polaridad “DTX3” son depuradas en Mytilus galloprovincialis más lentamente que el AO y sus derivados y, a su vez, cada grupo de derivados de baja polaridad presenta una tasa de depuración más baja que las toxinas de las que provienen, como se muestra en estudios que forman parte de esta tesis doctoral (Fernández et al., 1998). El primer hecho sugiere que los episodios tóxicos en los que la DTX2 esté implicada se prolongarán más en el tiempo que aquéllos en los que la toxina principal sea el AO. El segundo hecho sugiere que cuando los derivados acilados se produzcan en grandes cantidades, el proceso de detoxificación será más lento.

Existe muy poca información en lo que se refiere a la depuración de DTX4, DTX5 y diol ésteres. Su desaparición en los bivalvos procede más probablemente de un proceso de hidrólisis que da lugar a las toxinas carboxílicas, que de un proceso de eliminación. La combinación de transformación y depuración de las toxinas pudiera dar lugar a cinéticas complejas y de aparente incoherencia para cada una de las toxinas cuando se analiza independientemente y a dificultades de interpretación si las cinéticas de las toxinas no son modelizadas.