dimerización de CTDΔ177 mediante intercambio de dominios
Una primera observación que no apoya un papel del dímero de dominios intercambiados en el ensamblaje de la cápsida de VIH‐1 es la dependencia de la cantidad
DISCUSIÓN
conseguir un 60% de forma dimérica. Sin embargo, en nuestro estudio con este mismo mutante de la misma estirpe viral, la forma dimérica no sobrepasó, a pesar de la búsqueda de las mejores condiciones de dimerización, un 20% en el equilibrio a concentraciones relativamente elevadas de proteína. Además, la utilización de CTD‐Δ177 derivado de una segunda cepa de VIH‐1, cuyo CTD se diferencia en únicamente un aminoácido, redujo la proporción de dímero de un 16% a sólo un 5% en las mismas condiciones de ensayo en el equilibrio. Finalmente, la expresión de CTD‐Δ177 como proteína libre, en vez de como proteína de fusión con GST, produjo únicamente la forma monomérica. Es preciso recordar también que la deleción Δ177 en CTD fue artificialmente introducida en el laboratorio, y que en CTD sin mutaciones no se aprecia tendencia a formar dímeros de dominios intercambiados, sino únicamente dímeros
rmado
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fo s a través de la interfase presente en la cápsida madura.
Una segunda observación que tampoco favorece un papel funcional para el dímero de dominios intercambiados es que, incluso en el mutante CTD‐Δ177 donde la dimerización por intercambio de dominios está artificialmente favorecida, la constante de equilibrio de disociación del dímero es del orden de mM, cuando las interacciones biológicamente relevantes son casi siempre de mucha mayor afinidad (constantes de disociación del orden de nM o µM), como ocurre con la dimerización de CA y CTD sin intercambio de dominios.
Una tercera observación en el mismo sentido es que las cinéticas de asociación y disociación de CTDwt sin intercambio de dominios son extraordinariamente rápidas,
mientras que las cinéticas de asociación y disociación de CTD‐Δ177 son extremadamente lentas. La gran barrera energética que tiene que salvar CTD‐Δ177 tanto para dimerizar como para disociarse es debida, probablemente, a un mecanismo de asociación que implica el paso por un estado parcialmente desnaturalizado de la proteína, con el monómero en una conformación “abierta”, como se ha descrito para algunas otras proteínas que dimerizan mediante intercambio de dominios (Schymkowitz, et al., 2000; Rousseau, et al., 2001). Es difícil imaginar que un proceso de asociación necesario para el ensamblaje de la cápsida inmadura de VIH‐1, o un proceso de disociación necesario para su desensamblaje durante la maduración de VIH‐1, pueda tardar muchos días en completarse.
Sin embargo, también es preciso considerar que las condiciones en la célula y en el virión de VIH‐1 son muy diferentes a las de una solución diluida donde se han realizado todos estos experimentos, así como experimentos similares con otras proteínas que dimerizan mediante intercambio de dominios. En entornos fuertemente aglomerados como son los fisiológicos, la velocidad de las reacciones de asociación y disociación de complejos macromoleculares, y la posición del equilibrio químico, pueden resultar fuertemente alterados, como se ha comentado en la Introducción y en Resultados. Por tanto, consideramos de interés realizar en el futuro estos estudios de la reacción de dimerización mediante intercambio de dominios, pero en presencia de un agente de aglomeración macromolecular. Es también necesario recordar que en condiciones fisiológicas CTD no se encuentra aislado, sino que forma un dominio de Gag o de CA; en
DISCUSIÓN
este entorno molecular aumentará la concentración local de CTD, lo que también puede facilitar reacciones de oligomerización, incluyendo su dimerización mediante intercambio de dominios.
Los resultados de equilibrio y cinéticos obtenidos para la reacción de dimerización de CTD‐Δ177 son similares a los obtenidos para algunas de las pocas proteínas que dimerizan mediante intercambio de dominios y han sido analizadas en este tipo de estudios. En alguno de estos casos, como ocurre en el caso de CTD‐Δ177, la constante de equilibrio de disociación resultó ser del orden de mM, y las reacciones de disociación del dímero o asociación del monómero toman días o incluso meses en completarse. Es, sin embargo, necesario recordar de nuevo que en estos otros casos, la proteína que dimeriza mediante intercambio de dominios con tales constantes termodinámicas y cinéticas es la proteína natural, mientras que CTD‐Δ177 requirió una deleción en la región bisagra para alcanzar los valores determinados para la constante de equilibrio y las constantes cinéticas. En comparación, la deleción análoga de un aminoácido en otras proteínas que intercambian dominios permitió aumentar la constante de afinidad de dimerización en varios órdenes de magnitud sobre la obtenida para CTD‐Δ177 (Rousseau, et al., 2001).
El modelo más sencillo para explicar el equilibrio de dimerización de CTD‐Δ177 mediante intercambio de dominios implica, como se ha mencionado antes, un proceso de interconversión entre una forma monomérica y una dimérica a través de un estado de transición parcialmente desnaturalizado del monómero. En los experimentos de asociación del monómero hemos observado un buen ajuste a una única reacción bimolecular, dependiente de concentración, consistente con este modelo sencillo. Sin embargo, en los experimentos de disociación del dímero no hemos observado un único proceso exponencial de disociación. Los datos se ajustan bien a la existencia de dos procesos de disociación de dímero a monómero con constantes de velocidad lentas que difieren en dos órdenes de magnitud. Entre otras posibilidades, un modelo tentativo que podría explicar estos resultados es el siguiente: Para CTD‐Δ177 podrían existir dos formas diméricas algo diferentes, quizá con la posibilidad de convertirse una en la otra. Del ajuste de los datos, la forma de interconversión rápida sería dominante. Al tener ambas formas dimensiones similares, su interconversión (de haberla) sería invisible en experimentos de filtración en gel analítica, el método que hemos utilizado para seguir la reacción de disociación. Ambas formas se disociarían lentamente en monómeros, pero una. la dominante, lo haría mucho menos lentamente que la otra. La relación entre la constante cinética de disociación menos lenta y la constante de asociación del monómero rinde una constante de equilibrio de disociación que corresponde aproximadamente a la constante aparente determinada mediante la cuantificación directa de las formas
onomérica y dimérica en el equilibrio.
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