Future Directions

En el capítulo I, demostramos que los residuos de serina en las posiciones S23, S30 y S33 del C-terminal de los segmentos TM son críticos para la conformación quinasa. La hipótesis que planteamos consiste en que a bajas temperaturas, cuando la membrana está menos hidratada,

Página | 99 los grupos hidroxilo de las serinas forman enlaces de hidrógeno con la otra serina contraparte, considerando que DesK es un homodímero, de manera de estabilizar la interfaz del dímero. A mayores temperaturas, la membrana es más delgada y más hidratada; y los enlaces H serina- serina situadas en la interfase lípido-agua pueden ser desestabilizados ya que el agua o grupos fosfato de los alrededores pueden entrar en competencia; en consecuencia, generando la disrupción de la interfaz de dímero. Con el objeto de entender el mecanismo global de sensado y la alternancia entre las distintas actividades de la proteína, quisimos estudiar más en detalle la naturaleza química de esta dimerización.

En este capítulo nos abocamos a analizar en detalle la interacción por puente H que permite la dimerización y para ello nos valemos de estudios genéticos en B subtilis.

4.3.2. Resultados

4.3.2.1. El competidor electrostático

Para analizar el comportamiento de DesK en su entorno natural, se reconstituyó el MS-DesK en lípidos de Bacillus subtilis preparados según el método de Bligh y Dyer (ver M & M). La actividad autoquinasa fue medida a 37 °C y 25 °C. Sorprendentemente, la actividad del MS- DesK reconstituido en lípidos de B. subtilis es cuatro veces menor que en los lípidos heterólogos de E. coli (Fig. 6.1A), comparando sus velocidades iniciales de las pendientes de las curvas (4%UA/min para lípidos de E coli frente a 1 %UA/min para lípidos de B subtilis). El análisis comparativo de los lípidos presentes en cada celula muestra que los lípidos extraídos de B. subtilis tienen mayor contenido de PG que los lípidos de E. coli (45% frente a 20%) (Dowhan 1997 Op Den Kamp et al., 1969). Considerando que interacciones electrostáticas entre la superficie de la membrana cargada negativamente y la región linker fueron propuestas para modular la actividad (Inda y col., 2014), surgía la pregunta ¿es esta interacción lípido específico? Para entender este comportamiento diferencial en la actividad de DesK en diferentes lípidos, analizamos el efecto de lípidos cargados negativamente sobre la actividad in vitro del MS-DesK. MS-DesK se reconstituyó en liposomas con una proporción creciente de los siguientes lípidos cargados negativamente: 1,2-dioleoyl-sn- glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (DOPG) y cardiolipina (ver Materiales y Métodos, Fig 6.1B y C). La actividad quinasa fue medida a 25 ° C, temperatura que activa la conformación quinasa en presencia de [γ-32P] ATP. Como se ve, el aumento de contenido de PG disminuye considerablemente la actividad autoquinasa, sugiriendo que es este lípido cargado negativamente el que favorece las interacciones electrostáticas con la proteína, dificultando

Página | 100 así la capacidad de DesK para autofosforilarse (Fig. 6.1B). Tiene sentido que en los lípidos naturales de Bacillus subtilis el sistema tienda a estar repimiendo la expresión génica, siendo necesario para ello estabilizar el estado fosfatasa. De esta manera, en el entorno natural de DesK, la bacteria se asegura de que la señal debe ser lo suficientemente fuerte como para activar el sistema.

La cardiolipina, en cambio, no tiene un efecto inhibidor tan marcado (Fig. 6. 1C) a pesar de conservar la carga neta negativa, sugiriendo que otras propiedades de este lípido puedan estar también afectando la regulación del termosensor. Pensamos que si bien la cardiolipina conserva la carga negativa, la mayor rigidez que aporta este lípido a la membrana podría compensar los efectos inhibitorios, favoreciendo la actividad quinasa. Sin embargo, siendo ambos causas en sentidos opuestos es difícil identificar lo que la proteína está sensando. Para analizar si la interacción de la proteína con PG está mediada por el linker, se diseñó un péptido correspondiente a la región linker, incluyendo un fluoróforo (W): KSRKERERWEEK. Cuando se introdujo esta mutación (L160W) en la proteína, esta no afectó la regulación por temperatura del MS-DesK, (Fig. 6.2A). El péptido se incubó en presencia de liposomas marcados con dansilo, compuesto usado como quencher de la fluorescencia. Si el péptido interacciona con la bicapa lipídica, se observa FRET entre el péptido marcado con W y el dansilo de los liposomas (fig. 6.2B). Una transferencia de energía importante se observa cuando el porcentaje de la PG cargado negativamente se incrementa (0, 10, 30 y 50% DOPG), mostrando una disminución en la intensidad del pico de emisión de péptido (centrado en 350 nm por el W) y un aumento concomitante en la intensidad de emisión del pico del dansilo (centrado en 518 nm) (fig. 6.2C). La adición de concentraciones crecientes de sal a las mezclas de péptido-lípido disminuye el FRET, mostrando que la interacción electrostática entre el péptido y la membrana se disrumpe en presencia de sales (fig. 6.2D).

Página | 101 A. B. 1´ 5´ 10´ 20´ 40´ 1´ 5´ 10´ 20´ 40´ 1´ 5´ 10´ 20´ 40´ 1´ 5´ 10´ 20´ 40´ 0% Cardiolipina 10% Cardiolipina 20% Cardiolipina 30% Cardiolipina C.

Figura 6.1A. Actividad quinasa de MS-DesKC reconstituída en distintos entornos lipídicos. A. MS- DesK se reconstituyó en: BS, lípidos naturales purificados de membranas de B. subtilis y EC, lípidos polares de E coli; la actividad de la quinasa se midió a 25 ° C y a 37°C en presencia de [γ-32_{P] ATP. Las cantidades totales de} proteína fosforilada presentes en cada pocillo fueron determinadas por densitometría y se representan como porcentajes de la actividad. Los resultados corresponden al promedio de al menos tres experimentos independientes. B. Las cargas negativas favorecen el equilibrio hacia la actividad de la fosfatasa de DesK. El MS-DesK se reconstituyó en liposomas con concentraciones crecientes de DOPG o cardiolipina (10%, 20%, 30% mol/mol). La actividad autoquinasa se ensayó a los tiempos indicados y se cuantificó como en la Figura 1A.

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A. B.

C.

D.

Figura 6.2 A. La mutación L160Wen la región linker del MS mantiene la reguación por temperatura. B. Esquema explicativo del FRET entre liposomas marcados con dansilo y el péptido con un reemplazo puntual por W. El péptido correspondiente a la región linker se incubó con liposomas de concentración creciente PG (C) y en presencia de concentraciones crecientes de sal (D). La proximidad del péptido linker a la membrana fue estudiada por FRET.

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